南农 生物分离工程 双水相萃取课件.ppt

1、双水相萃取技术,Aqueous Two-Phase Extraction ATPS,基因工程产品如蛋白质和酶往往是胞内产品，产品的活性和功能对环境因素特别敏感。传统的溶剂萃取法并不适合。采用在有机相中添加表面活性剂产生反胶束的办法可克服这些问题，但同样存在相的分离问题。,发展历史,1896年 Beijeronck将琼脂水溶液与可溶性淀粉或明胶水溶液混合，发现了双水相现象 1956年 Albertsson分离叶绿体,开创了双水相 萃取技术,解决了蛋白质变性和沉淀的问题。 1979 年德国 的Kula 等人将双水相萃取分离技术应用于生物产品分离 建立ATPS的相图 研究蛋白质、核酸、病毒、细胞、细

2、菌、海藻、叶绿体和线粒体等在ATPS 中的分配系数,2.2的葡聚糖水溶液与等体积的0.72甲基纤维素钠的水溶液相混合并静置后，可得到两个粘稠的液层。,葡聚糖与甲基纤维素钠的双水相体系,双水相的形成,聚合物的不相溶性(incompatibility)：当两种高分子聚合物之间存在相互排斥作用时，当达到平衡时，即形成分别富含不同聚合物的两相。 除双聚合物系统外，聚合物与无机盐的混合溶液也可形成双水相，,PEG = 聚乙二醇(polyethylene glycol),Kpi = 磷酸钾,DX = 葡聚糖(dextran),双水相的形成,Phase 1: 4% polyethylene glycol i

3、n water Phase 2 : 4% dextran in water,Dr = 0.2 g / cc s = 1.2 dyne / cm,PEG,Dextran,双水相的形成,Monoph.,PEG %,各种类型的双水相体系,a,双节线,系线,b,双节线,均相区,均相区,两相区,两相区,系线,临界点,PEG/Dx系统的相图 PEG/KPi系统的相图,PEG6000， Dex的相对分子质量如下： 1.D5 (Mn2800， Mr3400) 2.D17(Mn23000，Mr30000) 3.D24(Mn23000) 4.D37(Mn88000，Mr179000) 5.D43(Mn180000

4、，Mr460000) 6.D170(Mn630000，Mr2200000) Mn数均分子量 Mr重均分子量,PEGDex体系的双节线和临界点,双水相萃取的原理,利用物质在不相溶的，两水相间分配系数的差异进行萃取的方法 溶质在双水相中的分配系数用m=c2/c1表示。 c1 和c2分别表示平衡状态下相和上相中溶质的总浓度。,双水相萃取的原理,一般而言，离子性大的蛋白质会出现在下层盐相，而疏水性较大的蛋白质则在上层聚合物相 各种细胞，噬菌体的分配系数一般大于100，或小于0.01; 蛋白质(如酶)的分配系数在0. 1 -10之间， 无机盐的分配系数一般近于1. 0 分配系数的差异，构成了双水相萃取分

5、离物质的基础。,双水相萃取的原理,生物分子的分配系数取决于溶质与双水相系统间的各种相互作用，主要有 静电作用 疏水作用 生物亲和作用 分配系数是各种相互作用的和: lnm=lnme+lnmh+lnml me，mh，ml 分别为静电作用、疏水作用和生物亲和作用对溶质分配系数的贡献。,3.0 2.0 1.0 0.1 0.05,0 1 2 3 4 5 6 7 8,胰岛素,溶菌酶,胰蛋白酶,a 凝乳蛋白酶,卵白蛋白,a 淀粉酶,牛血清白蛋白,铁传递蛋白,Protein Molecular Weight (X 10-4 Daltons),m (PEG phase / Dextran phase),PEG

6、 6000 - Dextran 500 Distribution Coefficient,实际的双水相系统中通常含有缓冲液和无机盐等电解质，在两相间产生电位差，分配系数表达式为,lnm=lnmo+FZ/RT,荷电溶质的分配系数的对数与溶质的净电荷数成正比 分配系数与静电荷数的关系因无机盐而异,2疏水作用,疏水性一定的蛋白质的分配系数受双水相系统疏水性的影响。有必要确定双水相系统的疏水性尺度 PEG/Dx和PEG/无机盐等双水相系统的上相(PEG相)疏水性较大，相间的疏水性差用疏水性因子HF (hydrophoblc factor)表示。 HF可通过测定疏水性已知的氨基酸在其等电点处的分配系数m

7、aa测算,盐对血红蛋白分配系数的影响,双水相萃取法流程图,双水相萃取的工艺流程,目的产物的萃取 PEG的循环 无机盐的循环,PEG的循环: 加入盐使目标蛋白质转入富盐相来回收PEG; 将PEG相通过离子交换树脂,用洗脱剂先洗去PEG,再洗出蛋白质。 无机盐的循环 将含无机盐相冷却，结晶，分离 电渗析法、膜分离法回收盐类或除去PEG相的盐。,影响生物物质分配的主要因素,影响物质分配的因素用实验的方法来确定满足分配要求的操作条件。,1 双水相中聚合物及其分子量的影响 降低聚合物的分子量，则蛋白质易分配于富含该聚合物的相中 聚合物的疏水性按下列次序递增: 葡萄糖硫酸盐 甲基葡萄糖 葡萄糖羟丙基葡聚糖

8、 甲基纤维素 聚乙烯醇聚乙二醇 聚丙三醇 同一聚合物的疏水性随分子量增加而增加,PEG平均分子量增大，分配系数减少。 当分子量为400时，K1，酶主要分布于上相， 当分子量大于400时，K1，酶主要分布于下相。 主要原因是随着PEG分子量的增大，其疏水性增加，使糖化酶转入下相，为了使酶分布于上相，应选用分子量为400的PEG。 PEG平均分子量对糖化酶分配平衡的影响 系统 K 相体积 产率 PEG400 (31.36)(NH4)2SO4 (14.05) 6.28 4.75 96.8 PEG1000 (21.77)(NH4)2SO4 (12.76) 0.26 3.0 43.5 PEG4000 (

9、12.67)(NH4)2SO4 (12.14) 0.30 4.1 59.8 PEG6000 (15.76)(NH4)2SO4 (12.34) 0.03 1.2 2.1,在PEG/Dex双水相系统中，PEG分子量的减少，会使蛋白质的m值明显增大。 Dex水解程度的不同，对m值也有一定的影响。,普鲁兰酶 (12PEG，1DexT 500， 100mmolL Na3PO4，pH7.5) 1,4- -葡聚糖磷酸酶 (9.3PEG，7DexT 500， 50mmolL Na3PO4，pH7.8) 亮氨酰基-tRNA合成酶 9.2PEG，6.3DexT 500， 73mmolL Na3PO4，pH7.8)

10、,PEG平均分子量对分配率的影响,成相系统的总浓度增大时，系线的长度增加,上相和下相相对组成的差别就增大，分配系数偏离临界点处的值，使产物富集于某一相。,PEG/Dx系统的相图,系线长度对分配平衡的影响,系线长度对分配平衡的影响,以PEG(NH4)2SO4系统双水相萃取糖化酶为例， 当PEG400浓度在2527时，分配系数高达47.3，浓度过高则不利于酶的分配； 在PEG400浓度固定为26时，增加(NH4)2SO4的浓度，糖化酶的分配系数也增大，这主要是由于(NH4)2SO4盐析作用影响增强的缘故，最适浓度为16，过高也不好，酶蛋白会因盐析作用过强而产生沉淀。,2 双水相系统物理化学性质的影

11、响,密度()，两相间的密度差，黏度()，两相间的黏度差，表面张力()。,3 盐和缓冲液的影响,产生不同相间电位 影响蛋白质的表面疏水性 扰乱双水相系统，改变各相中成相物质 的组成和相体积比 例如，PEG/KPi系 统随添加NaCl浓度的增大而改变。,在体系中加入适当的盐类，会促进带相反电荷的两种蛋白质的分离。 当pH 6.9时，溶菌酶带正 电，卵蛋白带负电。 在PEG/Dex体系中加入 NaCl，产生电位差， 导致带正电荷的溶菌酶 大量迁移到上相， 而带负电荷的卵蛋白 迁移到下相，从而使 溶菌酶和卵蛋白得 以较好地分离。,加入NaCl对卵蛋白 和溶菌酶分配的影响,相系统：8Dex 500； 8

12、PEG 4000， 0.5mmolL Na3PO4； pH6.9,4 温度的影响,当双水相系统离双节线足够远时，温度的影响很小，,大规模双水相萃取操作一般在室温下进行，不需冷却。 成相聚合物PEG对蛋白质有稳定作用， 常温下溶液粘度较低，容易相分离； 常温操作节省冷却费用。,温度的影响,pH 值的影响,改变两相的电位差。如体系pH 值与蛋白质的等电点相差越大, 则蛋白质在两相中分配越不均匀。,双水相萃取特点,体系有生物亲和性，相界面张力小 平衡时间短，操作简便， 易于放大，分配系数K值重复性好， 可与细胞破碎相结合 广泛地应用在生物化学、细胞生物学和生物化工领域，进行生物转化、蛋白质、核酸和病

13、毒等产品的分离纯化,双水相萃取技术的应用,目前较多地应用于胞内酶的提取和精制上。 处理细胞匀浆液，既可方便地除去细胞碎片，还可使酶得到精制。 应满足下列条件 欲提取的酶和细胞碎片应分配在不同的相中； 酶的分配系数应足够大，使在一定的相体积比时一次萃取，就能得到较高的收率； 两相用离心机很容易分离。,在双水相体系中，通常将目的蛋白质分配在上相(PEG)，而细胞碎片分配在下相(盐)。 蛋白质在多数情况下收率能达到90；分配系数K在220之间，一般能大于3；很多杂蛋白也能同时除去。 PEG盐系统应用得很广泛，主要由于PEG价格低廉以及该系统选择性。,萃取操作时单位重量相系统中匀浆液的加入量一般每1

14、kg萃取相系统以处理200400 g湿菌体为宜。 使用PEG盐系统提取胞内酶时，使细胞碎片分配到下相中是比较容易的，如用18%的PEG 1550、7磷酸钾系统处理20湿细胞碎片时，细胞碎片能全部转入下相(盐相)。,三步萃取流程示意图,连续错流萃取回收酶的流程图,双水相体系提取酶和蛋白质,括号内的数字表示萃取级数,双水相萃取技术在医药工业中的应用,基因工程药物的分离与提取 瑞典Alfa-Laval 公司用PEG4000(6.6%)/磷酸盐(14%)系统从重组大肠杆菌( E.Coli)碎片中提取人生长激素(hGH)，进行了3级错流萃取，处理量为15 L/h，总收率可达81%，纯化系数为8.5。,双

15、水相亲和萃取,以聚乙二醇(PEG)-磷酸酯/磷酸盐双水相系统，经两次萃取从重组大肠杆 菌匀浆液中提取 -干扰素。 最适宜的萃取条件是质量分数为22%PEG-磷酸酯、16%磷酸盐、 3%NaCl和pH6.9。 -干扰素的分配系数达到155，收率99.6%，纯度提高25倍。,反萃取的较好条件为20%PEG-磷酸酯、10%磷酸盐、pH6.0，收率可达75.6%。 与传统提取 方法相比，用双水相萃取技术可省去高速离心去除细胞碎片的步骤，操作简单，能耗较低， 而收率较高，纯度也有所提高。 最后的-干扰素存在于磷酸盐相， 其中PEG含量仅为0. 5%左右，对进一步纯化很有利。,在PEG-磷酸酯/磷酸盐双水

16、相系统中-干扰素完全分配在上相， 杂蛋白几乎全在下相，且-干扰素浓度越高、分配系数越大，纯化因子高达350，收率达9 7%，干扰素的特异活性大于10 单位/mg蛋白。,双水相系统应用于生物物质的分离纯化,双水相系统应用于生物物质的分离纯化,双水相萃取细胞、细胞器和膜的种类,双水相技术在抗生素分离中的应用,疏水作用是影响分配行为的主要作用。抗生素的发酵液中常含有同系物或副产物，根据其疏水性的差异进行分离。,Partition coefficients of antibiotics in ATPS,AKM: copolymer of maleic anhydride and ethylene ox

17、ide. EOPO : ethylene oxide - propylene oxide random copolymer.,Fig. 1 Simplified flow diagram of extractive purification by ATPP(fermentation broth of penicillin G processed was 1000 ml),天然植物药用有效成分的分离与提取,黄岑甙和黄岑素在PEG6000/ K2HPO4系统中主要分配在富含PEG的上相, 分配系数为30 和35 。 温度诱导双水相，实现聚合物的循环利用 萃取蜕皮激素和20 -羟基蜕皮激素是某些疾病

18、的诊断指示剂，亦为杀虫剂,双水相萃取技术在天然产物分离中的应用,稀有金属和贵金属分离,在聚乙二醇2000/ 硫酸铵/偶氮胂双水相体系中，可以实现Ti（钛） 与Zr（锆）的分离 在聚乙二醇2000/ 硫酸钠/ 硫氰酸钾双水相体系中，实现了Co、Ni、Mo等金属离子的定量分离 在聚乙二醇/ 硫酸钠双水相体系中，能从碱性氰化液中萃取分离金,工业应用所面临的问题,理论及技术均仍不是十分成熟 成相聚合物价格昂贵 提高选择性 从聚合物相中回收产物、循环利用聚合物与盐以降低成本,廉价双水相体系的开发 两种双水相体系的比较 体系 优点 缺点 PEG/dextran 盐浓度低，活性损失小 价格贵，粘度大，分相困

19、难 PEG/盐 成本低、粘度小 盐浓度高，活性损失大，界面吸附多 高聚物/高聚物体系对活性物质变性作用小，界面吸附少，但价格高。因而寻找廉价的高聚物/高聚物双水相体系是双水相萃取技术应用的一个重要发展方向。,开发低成本的双水相体系,Krone (1981) 首先利用粗dextran 取代 dextran , Folke (1987) 用变性淀粉PPT 取代dextran , dextran 可被羟丙基淀粉( reppal PES) 、糊精、麦芽糖糊精、乙基羟乙基纤维素( EHEC) 等代替 Skuse (1992) 利用羟基纤维素取代PEG PEG可被聚乙烯醇( PVA) 或聚乙烯吡咯烷酮(

20、PVP) 替代 磷酸盐被硫酸钠、硫酸镁、碳酸钾等取代,目前比较成功的是用变性淀粉PPT（hydroxypropyl derivative of starch）代替昂贵的Dextran。 PPT/PEG体系比PEG/盐体系稳定。和PEG/dextran体系相图非常相似： 蛋白质溶解度大。蛋白质在PPT浓度到15以前没有沉淀，而在PEG浓度大于5时，溶解度显著地减小。 粘度小。PPT的动力粘度只是粗Dextran的1/2，因而可以大大改善传质效果。 价格便宜。,开发新的聚合物,双水相胶束体系( two-phase aqueous micellarsystems) 去污剂形成的双水相体系 ( det

21、ergent-based aqueous two-phase system) 一种成相聚合物的双水相体系,上相几乎100 %是水,聚合物位于下相(如EOPO ,即环氧乙烷 (EO) 和环氧丙烷( PO) 构成的水溶性热分离高聚物,开发新的聚合物,Alred 采用乙烯基氧与丙烯基氧的共聚物(商品名UCON) 和PEG可形成温敏性双水相体系。常温条件下,PEG、UCON 和水混合后为均相体系,当加热到40 时,形成两相体系,上相为PEG和UCON ,下相为水, PEG和UCON循环利用,特殊水相萃取分离技术,开发新的聚合物,Kula 等开发了一种表面活性剂Triton 和水形成的热分离双水相体系,

22、当温度高于体系浑浊点时,表面活性剂和水形成双水相,上相为表面活性剂相,下相为水。 表面疏水性强的蛋白质易于分配在表面活性剂相中,菌体和亲水性蛋白质主要分配在水相中, 纯化胆固醇氧化酶, 收率高达90 %。,表面活性剂双水相,阴离子表面活性剂十二烷基硫酸钠(SDS) 和阳离子表面活性剂溴化十二烷基三乙铵(C12NE) 的混合体系,在一定浓度和混合比范围内形成两相, 含水量高(可达99 %) 、增溶作用 两相容易分离、表面活性剂的用量很小且可循环使用,后续色谱纯化工艺研究,双水相萃取同层析结合 PEG/ 盐体系具有价廉和分相容易的优点, 而疏水色谱又可在高盐浓度下操作 Schutte成功地利用疏水

23、色谱从盐相中分离纯化蛋白质,亲和双水相体系,为了提高双水相萃取体系的选择性， 化学修饰.即:在PEG或Dextran上.共价地接上具有基团特性或生物特性的亲和配基:离子交换基、疏水基团、染料配基以及单克隆抗体。 如(CH3)3N-PEG-N(CH3)3， ConA-PEG-ConA等。,亲和双水相体系,亲和双水相体系处理量大，选择性强 对-干扰素、甲酸脱氢酶和乳酸脱氢酶等多种生物制品大规模提取。,亲和双水相体系,用双水相亲和萃取技术从兔肌中提取乳酸脱氢酶(LDH)，选用了进口的两种 常用的染料 Cibaron Blue F3GA、Procion Red HE2B 以及国产的13种活性染料作为亲

24、和 配基，改变了把亲和基团结合到成相组分上的传统做法。,亲和双水相体系,在研究了PEG/无机盐、PEG/羟丙 基淀粉(PES)系统中游离染料的亲和分配行为的基础上，以LDH作为研究对象，选取了最佳染料，设计了从兔肌组织匀浆液中提取LDH的二次萃取工艺流程。 纯化因子达7，收率80%以上，萃取过程稳定可靠，并且聚合物和染料得以充分地循环 使用。,亲和双水相体系,利用接有染料配基的PEG/葡聚糖(Dex)双水相系统从猪肉 中提取LDH。 考察了不同染料配基、pH值、聚合物和缓冲液浓度等因素对亲和分配的影响。 经提取和纯化的LDH，比活可达456494U/mg蛋白。,金属亲和双水相萃取技术,抗体、凝集素等亲和配基不能在高盐浓度下操作 利用金属离子和蛋白质中精氨酸、组氨酸的亲和作用分离和纯化蛋白质 Wuenschell 等采用含有Cu2 + - IDA(亚氨基醋酸) - PEG的双水相系统萃取了亚铁血红素蛋白; Arnold 等用含有Cu2 + - IDA- PEG的双水相系统萃取了血红素 优点:亲和配基价廉;可用于PEG/ 盐体系,成本低;亲和配基再生容易,能进行