菌种选育方法2.ppt

1、1,生物工艺学,2 菌种选育(2),2,2.2 菌种选育,主要内容 自然选育 诱变育种 抗噬菌体菌株的选育 杂交育种 原生质体融合技术 DNA重组技术 菌种保藏,3,经典育种： 自然选育 诱变育种 带有一定的盲目性，尚属于经典育种的范畴。 定向育种： 转化、转导、原生质体融合、代谢调控和基因工程等较为定向的育种方法。 国内这些方法成功地用在生产上的例子较少，发达国家比较普遍,育种方法,4,2.2.1 自然选育,自然选育 自然突变 自然分离,5,1 自然选育,自然选育：不经过人工处理，利用菌种的自然突变(spontaneous Mutation)而进行菌种筛选的过程叫做自然选育。 自然突变：是指

2、某些微生物在没有人工参与下所发生的那些突变。 自然突变的原因 自然突变的频率 正突变和负突变,6,2 自然突变的原因,多因素低剂量的诱变效应 多因素低剂量的诱变效应：由一些原因不详的低剂量诱变因素引起的长期综合效应，例如充满宇宙空间的各种短波辐射、自然界中普遍存在的一些低浓度诱变物质以及微生物自身代谢活动中所产生的一些诱变物质(如过氧化氢)的作用等。 互变异构效应,7,四种碱基的第六位上的酮基和氨基，胸腺嘧啶(T)和鸟嘌呤(G)可以酮式或烯醇式出现，胞嘧啶(C)和腺瞟呤(A)可以氨基式或亚氨基式出现。平衡一般倾向于酮式和氨基式，因此，在DNA双链结构中以AT和GC碱基对为主。 可是在偶然情况下

3、T也会以稀有的烯醇式形式出现，因而在DNA复制到达这一位置的一瞬间，通过DNA多聚酶的作用，在它的相对位置上就不出现A而出现G。 如果C以稀有的亚氨基形式出现，在新合成的DNA单链的相对位置上就将是A而不是G。,自然突变-互变异构效应,8,互变异构效应-可以被诱变剂激发,9,间接引起置换的诱变剂: 5-溴尿嘧啶（5-BU）,5-BU是T的代谢类似物。当把某一微生物培养在含5-BU的培养液中时，细胞中有一部分新合成的DNA的T就被5-BU所取代。5-BU一般以酮式状态存在于DNA中，因而仍可正常地与A配对，这时并未发生碱基对的转换。有时5-BU会以烯醇式状态出现在DNA中，于是当DNA进行复制时

4、，在其相对位置上出现的就是G，而不是原来的A，因而引起了碱基对从原来的AT变至GC的转换。,10,5-BU在以酮式或烯醇式状态存在时引起的ATGC的转换,A:T G:C A:T A:Buk G:Bue G:C G:Bue A:T G:C A:Buk A:BU G:C A:T A:BU,11,碱基的置换,直接引起置换的诱变剂,HNO2,C,NH2,腺嘌呤,C,O,次黄嘌呤(Hk),A,T,T,C,C,OH,次黄嘌呤(He),12,大量统计分析后，发现碱基对发生自然突变的机率约为10-8-10-9。 自然突变有两种情况： 一种是生产上所不希望有的，表现为菌种的衰退和生产质量的下降，称为负突变； 另

5、一种是对生产有益的，表现为菌株生产性能的上升，称为正突变。,自然突变的频率，正突变和负突变,13,3 自然分离,自然分离:生产菌株经过一定时期的使用后须纯化，淘汰衰退的；保存优良的菌种。 从高生产水平批号中取样进行单菌落分离，从中选出比较稳定的菌株，用于生产。 突变株自然分离:经诱变的突变株会继续发生变异。其结果往往导致菌株不同类型的比例的改变，而低单位菌株在传代过程中往往占优势，必须进行自然分离。,14,自然选育简单易行，可以纯化菌种，防止菌种衰退、稳定生产、提高产量。 缺点是效率低、进展慢。自然选育和诱变育种交替使用，效果好。 自然选育(自然分离)的一般程序 把菌种制备成单孢子悬浮液，经过

6、适当的稀释以后，在固体平板上进行分离，挑取部分单菌落进行生产能力的测定，经反复筛选，以确定生产能力更高的菌株代替原来的菌株。,自然分离,15,2.2.2 诱变育种,诱变育种的基本原理 诱变育种的一般步骤 诱变育种工作中几个应该注意的问题 几种物理、化学诱变剂的使用方法,16,1 诱变育种的基本原理,诱变育种的理论基础是基因突变，所谓突变是指由于染色体和基因本身的变化而产生的遗传性状的变异。 染色体畸变和基因突变。 染色体畸变（chromosomal aberration)：是指染色体或DNA片断的插入（insertion)、缺失(deletion)、易位(translocation)、倒位(i

7、nversion)、重复(duplication)等。 基因突变(gene mutation)：是指DNA分子结构中的一对或几对碱基发生变化(又称点突变)。,17,突变类型,18,突变发生的原因,可分为自然突变和诱发突变。 自然突变是指在自然条件下出现的基因突变 诱发突变是指用各种物理、化学因素人工诱发的基因突变。 诱变因素有物理的、化学的和生物的三大类，见表6-1。,19,常用诱变剂及其类别,20,从Watson和Crick的DNA双螺旋结构模型中可看出，虽然两条单链之间的碱基受着互补规律的制约(即A必须和T，C必须和G配对)，但就一条单链来说四种碱基的排列顺序是不受限制的。 DNA的多样性

8、即碱基排列方式的多样性是遗传性千差万异的内在原因。,突变发生的原因,21,22,2 诱变育种的一般步骤,诱变育种整个流程主要是诱变和筛选两部分。 诱变：包括由出发菌株开始，制出新鲜孢子悬浮液 （或细菌悬液）经过诱变处理以后以一定稀释涂平板，至平板上长出单菌落等各步骤。 诱发所形成的突变与菌种本身的遗传背景、诱变剂种类及其剂量的选择和合理使用方法均有密切关系。,23,诱变育种,筛选：包括经单孢子分离长出单菌落后随机挑至斜面，经初筛和复筛进行生产能力测定和菌种保存(即将筛选出来的高产菌种保藏好)。 诱变育种的整个过程主要是诱变和筛选的不断重复，直到获得比较理想的高产菌株。,24,诱变育种的一般步骤

9、,25,3 诱变育种应该注意的问题,选择好出发菌株：产量高、对诱变剂敏感性大、变异幅度广。 复合诱变因素的使用：对野生型菌株，单一诱变因素有时也能取得好的效果，但对老菌种，单一诱变因素重复使用突变的效果不高，这时可利用复合因素来扩大诱变幅度，提高诱变效果。 剂量选择：凡既能增加变异幅度又能促使变异向正变范围移动的剂量就是合适的剂量。 变异菌株的筛选：营养缺陷型、抗反馈抑制/阻遏、组成型 高产菌株的筛选需要筛选条件的配合,26,4 诱变剂的使用方法,紫外线 快中子 氮芥 亚硝酸 N甲基-N硝基N亚硝，基胍(NTG),27,A 紫外线,紫外线的辐射光源便宜，危险性小，诱变效果好，应用最广泛。 对诱

10、变最有效的波长仅仅是260nm左右(253265 nm) 一般诱变时用菌(孢子)悬浮液进行处理，紫外灯的功率为15W，距离固定在30cm左右。 紫外线的作用机制：主要是形成胸腺嘧啶二聚体以改变DNA生物活性，造成菌体死亡和变异。,28,紫外线对DNA的损伤,对紫外线来说，嘧啶要比嘌呤敏感得多。嘧啶的光化产物主要是二聚体和水合物。紫外线的主要作用是使同链DNA的相邻嘧啶间形成共价结合的胸腺嘧啶二聚体。 二聚体的出现会减弱双链间氢键的作用，并引起双链结构发生扭曲变形，阻碍碱基间的正常配对，从而有可能引起突变或死亡。 在互补双链间形成嘧啶二聚体的机会较少。但一旦形成，就会妨碍双链的解开，因而影响了D

11、NA的复制和转录，并使细胞死亡。,29,30,紫外- NaNO2复合诱变育种,优势 菌群,紫外线辐射,NaNO2处理,驯化培养,正突变菌株,改良菌的性状远优于原始菌,31,紫外线对枯草芽孢杆菌BF7658的诱变效应,菌悬液的制备 （a）取培养48小时的枯草芽孢杆菌BF7658（产淀粉酶）的斜面4-5支，用无菌生理盐水将菌苔洗下，并倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中，振荡30分钟，以打碎菌块。 （b）将上述菌液离心（3000r/min，离心15分钟），弃去上清液，将菌体用无菌生理盐水洗涤2-3次，最后制成菌悬液。 （c）用显微镜直接计数法计数，调整细胞浓度为每毫升108个。 平板制作 将淀粉琼脂培养基

12、溶化后，冷至45左右时倒平板，凝固后待用。,32,紫外线诱变,紫外线处理 （a）将紫外线灯开关打开预热约20分钟。 （b）取直径6cm无菌平皿2套，分别加入上述菌悬液5ml，并放入无菌搅拌棒于平皿中。 （c）将盛有菌悬液的2平皿置于磁力搅拌器上，在距离为30cm，功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟及3分钟。 稀释 在红灯下，将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6（具体可按估计的存活率进行稀释）。 涂平板 取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板，每个稀释度涂平板3只，每只平板加稀释菌液0.1ml，用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作，取未经紫外线处理的菌稀释液涂

13、平板作对照。,33,培养：将上述涂匀的平板，用黑布（或黑纸）包好，置37培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。 计数：将培养48小时后的平板取出进行细菌计数，根据对照平板上菌落数，计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。 观察诱变效应： 将细胞计数后的平板，分别向菌落数在5-6个左右的平板内加碘液数滴，在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值（HC值）。与对照平板进行比较，根据结果，说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。,34,B 快中子,中子产生：中子可由回旋加速器、

14、静电加速器或原子反应堆产生。中子不直接产生电离，但能使吸收中子的物质的原子核射出质子来，因而快中子的生物学效应，几乎完全是由质子造成的。 快中子：中子分为快中子和慢中子。慢中子的效应同射线、射线和电子等照射时引起的基本相同，快中子较X射线、 射线具有较大的电离密度，因而能更多地引起点突变和染色体畸变。 剂量：用快中子进行诱变育种时，用菌悬浮液或长在平皿上的菌落进行处理，所用剂量范围约为1001500戈。,35,C 氮芥,氮芥是一种极易挥发的油状物，一般使用它的盐酸盐。应用时先使氮芥盐酸盐与碳酸氢钠起作用，释放出氮芥子气，再与细胞起作用而造成变异。,其盐酸盐结构式为：,36,氮芥的诱变机制、解毒

15、,诱变机制：氮芥能引起染色体畸变，是被利用得最早的一种诱变剂。青霉素产生菌的选育，获得了良好的效果。 解毒：氮芥盐酸盐在碳酸氢钠溶液中呈游离状态，甘氨酸能与氮芥(在碳酸氢钠参与下)结合，形成无毒化合物，因此它有解毒作用。其反应式为：,37,氮芥使用方法,配制活化剂和解毒剂 称取碳酸氢钠68mg加入蒸馏水10mL，即为活化剂； 称取碳酸氢钠136mg,甘氨酸120mg,溶解在200mL蒸馏水中，即为解毒剂。 将这两种溶液高压灭菌备用。 将一只小瓶和橡皮塞灭菌、烘干、称取约10mg的氮芥盐酸盐放入瓶中，再加入灭菌蒸馏水2mL，则成为每毫升含有5mg的氮芥盐酸盐溶液。,38,氮芥使用方法,吸取1mL

16、孢子悬浮液(浓度为200万孢子mL)于另一灭过菌的小瓶中，加入0.6mL缓冲液，再加入0.4 mL上述氮芥溶液，将橡皮塞盖紧，摇匀，此时瓶中的氮芥作用浓度为每毫升1mg。 加入氮芥溶液30秒钟后开始计算时间，达到所需要的时间后，用1mL注射器吸取0.1mL处理液加到9.9 mL的解毒剂中，使氮芥作用停止。,39,D 亚硝酸,诱变机理：亚硝酸是一种常用的有效诱变剂，其诱变作用主要是脱去碱基中的氨基。 例如A、C、G分别被脱去氨基而成为次黄嘌呤(H)、尿嘧啶(U)、黄嘌呤(X)等。复制时，它们分别与C、A、C配对。前两种情况可以引起碱基对的转换而造成突变。由A：T G：C，G：C A：T的转换已经

17、得到证实。由于X(黄嘌呤)的分子结构只能与C配对，不能与T配对；所以它不能引起G：C A：T的转换因而不会造成突变。 亚硝酸还会引起DNA两条链之间的交联而造成DNA结构上的缺失，机制不清楚。,40,A,亚硝酸诱变机理,41,亚硝酸诱变机理,42,亚硝酸很不稳定，容易分解成水和硝酸酐 (2HNO2 N2O3+H2O)：硝酸酐继续分解放出NO和NO2(N2O3 NO+NO2)。 可在临用前将亚硝酸钠放在pH4.5的醋酸缓冲液中，生成亚硝酸(NaNO2+H+ HNO2+Na+）,亚硝酸使用方法,43,E N甲基-N硝基N亚硝基胍(NTG),亚硝基胍是亚硝基烷基类化合物的一种，可诱发营养缺陷型突变，

18、不经淘汰便可直接得到12%-80%的营养缺陷型菌株，有超诱变剂之称。 应用原理： 酸性条件：在pH低于5-5.5的条件下，形成HNO2而引起菌种突变； 碱性条件：以重氮甲烷的形式对DNA起烷化作用； pH6时：两者均不产生，此时的诱变效应可能是由于NTG本身对核蛋白体引起的变化所致。 处理条件：NTG在甲酰胺中溶解度较大，用甲酰胺溶解NTG可以提高处理浓度。通常在浓度为300g/mL，温度为28和时间60分钟的条件下处理，容易获得高产菌株。,44,2.2.3 抗噬菌体菌株的选育,45,1 噬菌体的分布,噬菌体广泛分布在自然界，存在于土壤、肥料、粪便和污水中。 在工厂生产中，对排出的菌体如不及时

19、处理，便有可能在下水道的污水和四周土壤中滋生噬菌体，在情况严重时，甚至从空气中亦能分离到噬菌体。,T4 Bacteriophage (TEM x390,000),46,一种噬菌体感染大肠杆菌,47,噬菌体的意义 细菌基因转导 医药用途（1）鉴别细菌；（2）治疗的佐剂：如痢疾的预防与治疗，配合抗生素。 噬菌体的危害：微生物发酵工业深受噬菌体危害。例如抗生素工业、微生物农药和有机溶剂发酵等工业中，普遍存在着噬菌体的危害。当发酵过程污染了噬菌体后，轻者使发酵周期延长，发酵单位(产量)降低，重则造成倒罐，酿成经济损失，已成为发酵工业的大敌。,噬菌体的经济意义,48,2 抗噬菌体菌株的选育,在工业微生物

20、发酵过程中，有不少品种遭受噬菌体的感染，使生产不能进行。这种瓦解细胞的噬菌体称为烈性噬菌体。 在出现噬菌体以后必须选育抗噬菌体菌株和配合其他措施使生产继续进行。 由于噬菌体很易发生变异，因此又会出现新的噬菌体，对噬菌体原具有抗性的菌株又会出现不抗。所以既要不断收集噬菌体，又要不断选育新的抗性菌株，以确保生产正常进行。,49,A 抗噬菌体菌株选育的几种方法,自然突变 以噬菌体为筛子，敏感菌株的孢子不经任何诱变由其自然突变为抗性菌株，抗性突变频率很低。 诱发突变 敏感菌株先经诱变因素处理，然后将处理过的孢子液分离在含有高浓度的噬菌体的平板培养基上，经诱变后的存活孢子中，如存在抗性变异菌株就能在此平

21、板上生长。诱变可以提高抗性菌株的频率。 或将敏感菌孢子经诱变后接入种子培养基，待菌丝长浓后加入高浓度的噬菌体再继续培养几天，再加入噬菌体反复感染，使敏感菌被噬菌体所裂解，最后取再生菌丝进行平板分离，从中筛选抗性菌株。,50,B 抗噬菌体菌株的特性试验,无论从自然突变或诱发突变所得到的抗噬菌体菌株，在用于生产之前，均需经过反复验证，才能使用。 抗噬菌体性状的稳定性试验 抗性菌株分别在孢子培养、种子培养和发酵培养过程中用点滴法或双层琼脂法测定噬菌斑。 不出现噬菌斑，说明该菌株对此噬菌体具有抗性。 观察抗性菌株多次传代后对噬菌体的抗性是否稳定。,51,+ Phage,Assay for Lytic Phage,52,噬菌斑,53,抗性菌株的产量实验,在选育