DNA多态性分析基础ppt课件

1、第 三 章 DNA多态性分析基础,学习目的,掌握DNA分子结构 掌握DNA的理化性质 掌握人类基因组的基本特点 掌握突变类型及产生机理 掌握长度多态性和序列多态性的基本概念,人类DNA遗传标记-法医物证学应用研究的热点 由常量检材到微量检材 -微量检材的检验 由蛋白质水平到DNA水平 -陈旧检材的检验、取材的广泛性 实现了仅能否定到高概率肯定 -提高了法庭证据的可靠性 人类DNA遗传标记-特定的座位上出现等位基因 出现在编码区或非编码区 表现为序列多态性或长度多态性,第一节 DNA分子结构与功能 一、DNA的分子结构 DNA是由4种核苷酸通过磷酸二酯键连接成的线性多聚体 1.DNA的基本结构单

2、位 碱 基 A G C T 核 苷 核苷酸,脱氧核苷酸=碱基+脱氧核糖+磷酸,dNTP dNDP dNMP,2.DNA的分子结构 一级结构-DNA分子中核苷酸的排列顺序 链接方式 3,5磷酸二酯键连接 戊糖和磷酸构成多聚核苷酸对骨架 含氮碱基突出于骨架上 不对称末端 5-自由的磷酸，3-游离的羟基 生物学意义 1. 遗传信息的载体 2. 构成DNA遗传标记的结构基础,二级结构-两条DNA单链形成的双螺旋结构 双螺旋结构的特征 1. 两条单链逆向平行排列， 绕同一中心轴形成双螺旋 2. 两条单链间以氢键连接 碱基互补原则：A=T,C=G * 稳定性与G+C含量呈正比 * 嘌呤和嘧啶相等: A+G

3、=C+T 配对原则的意义 1.复制的分子学基础 遗传信息传给子代 2.转录的分子学基础 RNA合成的模板 蛋白质 3.DNA多态性分析的分子学基础 DNA遗传多态性,三级结构-超级螺旋结构 结构特征 真核生物DNA三级结构-核小体 140bpDNA双链缠绕组蛋白8聚体 60bp的连接链（结合有组蛋白H1） 生物学意义 压缩DNA分子体积，有利于在细胞 中包装组蛋白对DNA分子完整性的 保护作用 统计数据 人类基因组DNA直线长2m 细胞核直径5um DNA分子被压缩了近一万倍,二、DNA的理化性质 DNA是生物大分子，因此具有高分子物质的一般性质 粘 性 较大 溶液的粘性与溶质分子的不对称性有

4、关 两性电解质 DNA含有磷酸基团（-）和含氮碱基（+） 等电点低-中性或弱碱性溶液-带负电 电泳技术进行分离的分子基础 可以与金属离子（Na,K,Mg.Mn）结合成盐 DNA+盐（乙醇或异丙醇）DNA沉淀析出 可以和碱性蛋白组氨酸结合 使DNA分子更具有稳定性 吸收紫外线 碱基含有共轭双链 ( 最大吸收波长260nm ) 对DNA样品进行定量分析,1.DNA的变性 概念：在加热、溶液碱性、有机溶剂、二甲基亚砜、甲酰胺等条件 下，DNA双链间的氢键断裂，形成两条单链DNA分子的过程。 变化：溶液粘度降低,沉降速率增加,浮力密度上升,紫外线吸收增强 增色效应随温度上升，DNA溶液的紫外线吸收增强

5、，A260值 DNA对紫外线吸收强度与变性程度成正比 OD260值：双链DNA 单链DNA 单核苷酸 融链温度随温度上升，一半DNA分子变性时的温度 (Tm值) Tm值与DNA分子中G/C含量呈线性关系 估计DNA的GC含量 ( G+C)% = (Tm69.3) 2.44 估算引物的Tm 值 Tm = 4 ( G + C ) + 2 ( A + T ) Tm值受介质中离子强度的影响（ Tm值与退火温度有关） 在高离子强度溶液中相对稳定（1mol/L NaCl） 某些因素影响下DNA分子共价键断裂小片段DNA的过程：DNA降解,2.DNA的复性 概念：当撤除变性因素后，原变性的两条互补DNA单链

6、通过碱基配对又重新缔合成为双链结构的过程叫复性。 * 加热后变性的DNA在温度降低过程中的复性又称为退火 影响：温度影响：最适为Tm以下25，过高不易复性；过低碱基错配 离子强度：足够盐浓度中和DNA分子携带负电荷利于复性 分子结构：简单序列的、小分子DNA-易发现互补序列-复性快 溶液浓度：高浓度DNA溶液比低浓度DNA溶液易复性 * 影响复性过程的主要因素：复性温度与溶液的离子强度 杂交：在复性的条件下，来源不同、但具有碱基互补的DNA单链按碱基 配对原则形成双链DNA分子的过程称作杂交。 * 局部碱基序列具有同源性的DNA分子也能形成局部杂交产物 杂交技术：在复性条件下，探针与靶DNA单

7、链形成杂交双链 用以分析两核酸分子间的碱基互补程度 探 针：标记有示踪物的寡核苷酸片段,第二节 人 类 基 因 组 基因组概念 广义概念：一个生物体的所有基因或遗传物质 狭义概念：一大组基因、一个染色体或几个染色体的基因 * 基因组包含基因序列(20-30%) + 非基因序列(70-80%) 基因组构成 核 基 因 组：单倍体细胞内的全部DNA分子，3109 bp 体细胞22对常染色体和1对性染色体 性细胞22条常染色体和1条型染色体 * 每个细胞含相同的基因组拷贝（特殊除外） * 平均每个细胞含有610pg的DNA 线粒体基因组：线粒体内包含的全部DNA分子，16569bp * 每个细胞平均

8、有800个线粒体 * 每个线粒体含有10个DNA拷贝,一、人类核基因组DNA 1.基因与基因有关序列 基因组成：包括合成有功能的多肽链或RNA所必需的全部序列,真核生物-断裂基因 基因中编码序列被若干个插入序列分隔的不连续的镶嵌结构 编码序列-外显子( n ) 10%50% 插入序列-内含子(n-1) 50%90% 决定基因长度 编 码 率-编码序列长度占整个基因序列的比例 外显子 内含子 转录：模板DNA 初级RNA 成熟RNA 剪接方式：特定外显子+不同外显子-表达多种产物 表现为外显子/或 内含子-表现多种功能 由同一DNA序列可以得到不同的mRNA，从而编码多种 具有部分重叠序列的蛋白

9、质的基因称为重叠基因,GT AG GT AG,基因分类 结构基因：合成结构蛋白、催化生化反应的酶 调节基因：阻遏蛋白或激活蛋白，控制基因活性 既可以转录成RNA，又可以翻译成蛋白质 rRNA基因：产物是核糖体的核糖体RNA tRNA基因：产物是转移RNA 只转录产生相应RNA，而不翻译成蛋白质 相关序列 前导序列和尾随序列-能被转录，但不被翻译 启 动 子：RNA聚合酶与DNA结合起始部位 位置：基因转录起点上游（5-1kb) 作用：能与RNA酶结合，调控基因表达 增 强 子：调节基因产物与DNA结合的部位 位置：在基因的任何位置。 作用：促进转录活性，增强启动子 2.基因外DNA 功能不清，

10、多拷贝或低拷贝形式；30%串联重复,3.重复序列 概念：在基因组中反复出现，在基因组中含有一个以上序列相 同的拷贝称为重复序列- 基因外的重复序列较少受选择压力的限制，在个体间具有变异性，是形成DNA多态性基础 分类：反向重复序列-两个序列相同的拷贝在DNA上呈反向排列 重复序列间有间隔 位于基因调控区内 重复序列间无间隔 与基因的转录、复制有关 串联重复序列-相对恒定的序列为重复单位，首尾相接 大卫星DNA（macrosatellite DNA） 主要在在非编码区 小卫星DNA ( minisatellite DNA ) 与染色体折叠压缩 微卫星DNA (microsatellite DNA

11、） 和染色体配对有关 散在重复序列-相同序列的重复单位散在分布 短散布元件 500bp Alu序列 序列长平均250bp，含有Alu I酶切位点（AGCT） 同源性高达80%，但具有种属特异性 人类Alu序列长300bp（130bp+31bp+130bp） 长散布元件 6-7kb Kpn序列 约6500bp,卫星DNA,发现：DNA主带以外有多个小的卫星带 分类：大卫星-根据浮力密度不同 1.687 卫星DNA（25-48bp） 1.693 卫星DNA（5bp-ATTCC-） 1.697 卫星DNA（5bp-ATTCC-） 1.700 卫星DNA（隐蔽的卫星DNA) 卫星DNA 重复单位171

12、bp 灵长类特有 卫星DNA 重复单位68bp 富含GC 位于多个染色体的着丝粒与异染色质 成分：GC含量少于主带中的DNA 特征：DNA呈串联重复形式 各类型家族成员序列G/C含量近似 具有相同的浮力密度 但是重复序列特征有明显差异,所有串联重复DNA序列都称为-卫星DNA 根据重复序列长度和序列特征分类 小卫星DNA 微卫星DNA ( minisatellite DNA ) (microsatellite DNA） 重复单位 15bp-30bp 2bp-6bp 重复次数 数次至数百次 10bp-60次 序列总长 100bp-20kd 300bp 序列特征 核心序列 单拷贝 多态原因 VNT

13、R STR 形成机制 不等交换，重组 复制滑动 主要分布 近端粒处，着丝点 内含子、间隔DNA 有特定的基因座定位 有特定的基因座定位 核心序列-富含G/C或A/T的保守序列 不同小卫星高度同源性-DNA指纹技术,4.假 基 因：与正常功能基因在核苷酸序列上相似，但不能转录或 转录后生成无功能基因产物的DNA序列。 突变：复制-失去调控；转录-拼接信号；翻译-终止信号 其他：丢失5或3端部分而失去活性基因片段 5.多基因家族：一组具有功能相似、来源相同、碱基序列相同或部分相 同的基因 产物：编码 R N A snRNA, tRNA, rRNA 编码蛋白质 组蛋白、珠蛋白、生长激素 位置：同一个

14、染色体上或不同染色体上 分类：多 基 因 家 族（rRNA基因家族） 散在基因家族（珠蛋白基因家族） 超基因家族：是一组由多基因家族和单基因组成的更大的基因家族。 各成员（免疫球蛋白、组织相容性复合体） 6.转座子：DNA分子内部或分子间可以移动的DNA片段 组成：由座位酶和转座子两末端的反向重复序列组成 特点：保留原位的序列，新合成复本的插入，可以遗传 部位：不固定（内含子、基因侧翼序列、插入编码区 ）,转座子的作用示意图,7.端粒 线性形式基因组DNA的末端都有一个特殊结构，是一段DNA和蛋白质形成的复合结构 特点：仅存在于真核生物，富含G的寡核苷酸序列 多个串联重复序列组成，重复单位为

15、5bp-8bp（-TTAGGG-） 重复次数为800-3000次，总长度515kb 作用：在端粒酶参与下，封闭染色体末端，维持染色体稳定性的作用 DNA复制：由于受DNA聚合酶特性限制，子代DNA链的最后 一个片断去除引物后，无法填补空隙，易造成子代 DNA链的缩短。 端 粒 酶：由RNA与蛋白质组合成的酶，以自身携带的RNA为模板 合成互补链，直接从末端起始DNA的合成 意义：端粒长度与年龄、细胞分裂次数有关，存在性别、种族和组织差,DNA甲基化,DNA甲基化是指在甲基化酶的作用下，将一个甲基添加在DNA分子的碱基上。 DNA甲基化修饰决定基因表达的模式，即决定从亲代到子代可遗传的基因表达状

16、态。 DNA甲基化的部位通常在CpG岛的胞嘧啶 胞嘧啶甲基化反应,在结构基因的调控区段，CpG二联核苷常常以成簇串联的形式排列。结构基因5端附近富含CpG二联核苷的区域称为CpG岛(CpG islands)。 CpG岛是CG二核苷酸含量大于50%的区域。CpG岛通常分布在基因的启动子区域。,基因组印迹：人类基因组中一些基因只表达一种亲源的基因版本，这种现象称为基因组印迹 两个亲本等位基因的差异性甲基化型造成了一个亲本等位基因的沉默，另一个亲本等位基因保持等位基因活性(monoallelic activity)。 DNA甲基化在法医学可能应用 1 亲子鉴定：从母血中检测胎儿的DNA，应用基因组印

17、记 确定亲代的必需基因。 2 混合斑分析 3 个人识别：年龄判断，甲基化标记和SNP标记的复合分析，同卵双生子的鉴定。 4 组织来源鉴定,第三节 基 因 突 变 概念：基因碱基组成的改变，又称为点突变。 野生型-自然界存在的，无DNA分子改变的个体表型 突变型-突变后的表型 方式：碱基的替换 转换-同一类型碱基的替换 顛换-不同类型碱基的替换 插入和缺失 在DNA序列中插入或缺失一个或几个碱基 后果：编 码 区-碱基突变导致相应密码子的改变 同义突变 - 氨基酸不变 中性突变 - 氨基酸改变，不影响蛋白质功能 错义突变 - 氨基酸改变，影响/不影响功能* 无义突变 - 终止密码子形成，产物无功

18、能 移码突变 - 阅读框改变，肽链延长或缩短 非编码区-没有表达产物，多不构成实质性影响 人类非编码区的序列变异远比编码区多,第四节 DNA 多 态 性 DNA 多 态 性 基因组DNA中,由不同碱基结构的等位基因所形成的多态性 产生机制点 突 变-序列多态性 插入或缺失-长度多态性 存在部位编 码 区 非编码区 DNA遗传标记 是特定的碱基序列 遵循孟德尔遗传规律 具有终身不变的遗传特征,一、DNA长度多态性 同一基因座上各等位基因之间DNA片段长度差异构成的多态性 1.可变数目串联重复序列广义指小卫星和微卫星（ STR ） ，狭义指小卫星 小卫星(variable number of ta

19、ndem repeats, VNTR） 特征：重复单位9bp-24bp、重复数次至数百次、 总长0.1-2.0kd，有特定的染色体定位 多态性结构基础-不同个体所含串联重复序列拷贝的差异 不同的个体，不同等位基因的串联次数不同， 形成不等长度的等位基因 同一基因座，每个等位基因之间的长度差异 刚好是重复单位的整倍数 不同基因座，小卫星VNTR序列间具有同源性核心序列 可以发生相互杂交 *多基因座DNA探针RFLP分析的理论基础, 高度多态性个人识别的重要依据 某基因座杂合度高100% 例：重复单位 17bp 重复次数 70-450次 片段长度 1190-7650bp 等位基因数 = 381 基

20、 因 型数 = 72771个 H=0.9974 DP=0.99999992 VNTR等位基因频率0.1%-10%,DNA指纹图,核心序列-DNA指纹技术的理论基础 发现：1985年Jeffreys报告 人肌红蛋白基因第一内含子 重复单位33个碱基，重复4次 核心序列16个碱基 探针：筛选出8个阳性克隆 核心序列-GGAGGTGGGCAGGAXG- 确定探针:33.6 AGGGCTGGAGG 33.15 AGGTGGGCAGGTGG 分析：DNA酶切片段（HinfI） 电泳分析 转移印迹 探针杂交 RFLP图谱（20条左右的片段） *偶合几率10-11-10-12,2.短串联重复序列（short

21、 tandem repeats, STR) 特征：重复单位2bp-6bp 不宜用RFLP方法分析 实质也是一种VNTR PCR扩增没有优势扩增 重复次数5次-60次，总序列长度400bp 微卫星DNA 适用于降解DNA的鉴定 最常见是二核苷酸，法医常用的是四核苷酸重复 必须用高分辨率的电泳方法分离 分布广泛，人类基因组的5%，估计20-50万个 检出8000多个，遗传标记数目多 绝大多数分布非编码区，极少三核苷酸位于编码区,微卫星大多数是二核苷酸，但在法医物证的鉴定中应用的大多数是四核苷酸，因为其STR重复PCR扩增结果更稳定，产生的附加带、影子带少，容易分型，所以在法医物证学上应用最为广泛。

22、 三核苷酸重复长度的变异可导致疾病，脆性X综合征、X连锁脊髓和延髓性萎缩和肌强直性营养不良症等遗传疾病的发生是三核苷酸串联重复的拷贝数大大增加所致。,类型：根据重复单位的碱基组成分为以下三类： 重复单位长度 重复单位组成 简单重复序列 基本一致 基本一致 复合重复序列 基本一致 组成不同 复杂重复序列 长度不同 组成不同 筛选 基本条件： 多态性程度高 、扩增稳定性好 1.等位基因长度0.8，个人识别能力0.9 5.基因频率分布比较平均 6.PCR扩增稳定、突变率低,复杂重复序列,命名 基 因 座 结构基因内含子中STR基因座 -按STR序列的GenBank注册基因名称命名 例：HumTH01

23、 酪氨酸羟化酶基因第1内含子 非编码区/定位不清的STR基因座 -Genome Database原始序号 例：D3S1359 DNA 3号染色体;单拷贝;1359号 等位基因 不同实验室检验结果的可比性和重复性 按照重复单位次数命名 5-GGTCATCATCATGG-3 “TCA TCA TCA” “CAT CAT CAT” * 从离5端最近的核苷酸开始定义 含有不完全重复的等位基因 （完整重复等位基因数）（不完全碱基数） 例:TH01基因座9.3基因 ATG4ATGAATG5,3.长度多态性形成机制 （1）复制滑动 类型：正向链3-5的滑动错配 在正向链中插入1个重复单位 反向链3-5的滑动

24、错配 正向复制链中缺失1个重复单位 特点：1.多发生在相似碱基结构区域，更倾向较短重复序列 是STR多态性的主要原因 2.插入比缺失多见，卫星序列有自我加速复制、延长 该序列，可以减轻编码区承受的选择压力 3.滑动错配是DNA半保留复制的关系 只要出现不对称环，多为滑动错配,（2）同源重组 概念：发生在联会复合体内的，同源染色体的两条非姊妹染 色单体之间的遗传物质交换 条件 1.交换区域的核苷酸序列必须相同或相似 2.交换链间碱基互补，重组发生在同一基因座 3.DNA序列的交换在重组酶催化下进行 机制：不等交换-交换双方地位平等，但数量不一定相等 证据：核心序列G/C含量与碱基序列和大肠杆菌序

25、列类似 序列是原核生物基因组DNA重组的信号 以VNTR的核心序列为探针与减数分裂中期的人染色体杂交，发现信号集中在染色体着丝点及附近 意义：法医学-形成DNA片段长度多态性 遗传学-非编码区的小卫星高度遗传变异减轻编码区选择压力，维持物种稳定,交叉上方染色体位置不变，下方绕交联桥转180度,Holliday结构,（3）基因的结构重排 概念：通过基因的转座，DNA的断裂错接使正常基因顺序发 生改变 机制：结构重排是一种DNA双链断裂的修复过程。 DNA断裂（5端的重复序列内）-形成两个游离末 修复过程中：末端的因摆动或错位基因转移移动 部位：基因内重排-单链末端的碱基率先复复性 然后合成空缺的碱基，形成插入重复单位 TCC TCC TCC TCC TCC TCC TCC TCC AGG AGG AGG AGG AGG AGG A