生物工艺学第三章工业培养基及其设计.ppt

1、生 物 工 艺 学,国家十一五规划教材生物工艺学（邱树毅主编）配套课件,目录,第一章绪论 第二章工业微生物菌种选育、制备与保藏 第三章工业培养基及其设计 第四章生物工艺过程中的无菌技术 第五章生物反应动力学 第六章 发酵过程原理 第七章 生物反应器及生物工艺过程的放大 第八章 生物反应过程参数检测与控制 第九章 生物产品分离及纯化技术 第十章 生物产品工艺学及应用,第三章工业培养基及其设计,3.1 工业培养基的基本要求 3.2 工业培养基的成分及来源 3.2.1 碳源 3.2.2 能源 3.2.3 氮源 3.2.4 无机盐及微量元素 3.2.5 生长调节物质 3.2.6 水 3.3 培养基类型

2、 3.3.1 制备培养基的基本原则 3.3.2 培养基的种类及其应用 3.4 培养基设计原理与优化方法 3.4.1 培养基的设计原理 3.4.2 培养基的优化方法,一般设计适宜于工业大规模发酵的培养基就要遵循以下原则： 必须提供合成微生物细胞和发酵产物的基本成分。 有利于减少培养基原料的单耗，即提高单位营养物质的转 化率。 有利于提高产物的浓度，以提高单位容积发酵罐的生产能力。 有利于提高产物的合成速度，缩短发酵周期。 尽量减少副产物的形成，便于产物的分离纯化。 原料价格低廉，质量稳定，取材容易。 所用原料尽可能减少对发酵过程中通气搅拌的影响，利于提高氧的利用率，降低能耗。 有利于产品的分离纯

3、化，并尽可能减少 “三废”物质的产生。,3.1 工业培养基的基本要求,工业培养基是提供微生物生长繁殖和生物合成各种代谢产物所需要的，按一定比例配制的多种营养物质的混合物。,3.2 工业培养基的成分及来源,碳源,水,生长调节物质,无机盐及微量元素,氮源,能源,不同营养类型的微生物利用不同的碳源。为数众多的异养微生物常利用某类有机化合物中的一种或几种作为它们的碳源。首先，糖类是微生物最广泛利用的碳源，尤其是葡萄糖，其次是醇、有机酸或脂肪酸等。而其余微生物或是利用CO2或碳酸盐作为唯一或主要的碳源，如蓝细菌等光能自养微生物和硝化细菌等化能自养微生物；或是利用CO2及相对低分子质量的简单有机物作为主要

4、碳源，如紫色非硫细菌等光能异养微生物。,不同微生物利用碳源物质的范围也很不相同。有的微生物利用的碳源物质范围很广。例如，洋葱伯克霍尔德氏菌(Burkholdria cepacia)可以利用90多种不同类型的有机化合物作为碳源。而有些微生物所能利用的碳源物质种类极其有限。 对于为数众多的化能异养微生物来说，碳源是兼有能源功能的双功能营养物。,3.2.1 碳源,能源是提供微生物生命活动所需能量的物质。极大多数微生物的能源物质是化学物质(有机化合物和无机化合物)。只有光合细菌利用光作为能源。但微生物生长过程中所涉及的能量主要是ATP形式的化学能。即使是光合细菌，也要将光能转换成ATP形式的化学能后才

5、可利用。,3.2.2 能源,氮是微生物细胞需要量仅次于碳的元素。能提供微生物所需氮素的营养物质称为氮源。 主要功能：提供细胞原生质和其他结构物质中的氮素，一般不作为能源使用。但化能自养细菌中的亚硝化细菌和硝化细菌能从NH3和NO2等还原态无机含氮化合物的氧化过程中获得其生命活动所需的能量。 对于硝化细菌来说，NH3和NO2是兼有氮源与能源功能的双功能营养物质。对于异养微生物来说，含有C、H、O、N的有机化合物是具有碳、能源和氮源三重功能的营养物。,3.2.3 氮源,微生物除了需要碳源、能源和氮源之外，还需要P、S、K、Mg、Ca、Na、Fe、Co、Zn、Mo、Mn、Ni和W等元素，大多是以无机

6、盐的形式提供的，故称为无机盐或矿物质元素。 大量元素：需要浓度在10-310-4mol/L范围内的元素，如P、S、K、Mg、Ca、Na和Fe等； 微量元素：需要浓度在10-610-8mol/L范围内的元素，如Co、Zn、Mo、Mn、Ni和W等。,3.2.4 无机盐及微量元素,生理功能： 提供微生物细胞化学组成中(除C和N外)的重要元素，如P核酸的重要组成元素； 参与并稳定微生物细胞的结构，如P参与的磷脂双分子层构成了细胞膜的基本结构等； 与酶的组成和活力有关。如Fe是细胞色素氧化酶的必要组分等； 调节和维持微生物生长过程中诸如渗透压、氢离子浓度和氧化还原电位等生长条件； 用作某些化能自养细菌物

7、能源物质，如NO2被硝化细菌用作能源； 用作呼吸链末端的氢受体，如NO3 被硝酸盐还原细菌用作无氧呼吸时呼吸链末端的氢受体。,许多微生物除了需要碳源、能源、氮源与无机盐之外，还必须在培养基中补充微量的有机营养物质才能生长或者生长良好，这些微生物生长所不可缺少的微量有机物质就是生长因子。生长因子有维生素、氨基酸、嘌呤碱和嘧啶碱、卟啉及其衍生物、固醇、胺类、C2C6直链或分支脂肪酸等。一些特殊的辅酶也能用作生长因子。,3.2.5 生长调节物质,生长因子的主要功能是提供微生物细胞重要化学物质(蛋白质、核酸和脂质)、辅因子(辅酶和辅基)的组分和参与代谢。 但是，有些微生物可以合成并分泌大量维生素等生长

8、因子，因此，可用作维生素等生产菌，例如，利用阿舒假囊酵母(Eremothecium ashbyii)和棉阿舒囊霉(Ashbya gossypii)生产维生素B2，用作B12生产菌的有谢氏丙酸杆菌(Propionibacterium shermanii)、橄榄链霉菌(Strep-tomyces oliuaceus)、灰色链霉菌(S.griseus)与巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)等。,水以自由水与结合水两种形式存在。结合水没有流动性和溶解力，所以微生物不能利用它。水的可利用性常用水活度(aw)来表示：水活度以相同温度下，溶液或物质上面空气的蒸汽压与纯水蒸汽压之比

9、表示： 水活度(aw)=P溶液/P纯水 纯水的aw值为1。有溶质时，水活度就低于1。,水是微生物营养中不可缺少的物质，主要是因为： 水是微生物细胞的主要化学组成； 水是营养物质和代谢产物的良好溶剂，营养物质与代谢产物都是通过溶解和分散在水中而进出细胞的； 水是细胞中各种生物化学反应得以进行的介质，并参与许多生物化学反应；水的比热高，汽化热高，又是热的良好导体，保证了细胞内的温度不会因代谢过程中释放的能量骤然上升； 水还有利于生物大分子结构的稳定。,3.2.6 水,3.3 培养基类型,3.3.1 制备培养基的基本原则,条件适宜 微生物的生长除了取决于营养之外，还受pH、氧气、渗透压等物理化学因素

10、的影响，而微生物的生长反过来又会影响环境条件。为使微生物良好地生长、繁殖或积累代谢产物，必须创造尽可能适宜的生长条件。,目标明确,营养协调,经济合理,条件适宜,pH,渗透压及 其他条件,目标明确 根据培养的对象和目的，如培养何菌，获何产物，用于实验室还是大规模生产以及作种子培养用还是发酵用来制备培养基。,渗透压 培养嗜盐微生物(如嗜盐细菌)和嗜渗 透压微生物(如高渗酵母)时就要提高培养基的渗透压。培养嗜盐微生物常加适量NaCl，海洋微生物的最适生长盐度约3.5%。培养嗜渗透压微生物时要加接近饱和量的蔗糖。,营养协调 培养基应含有维持微生物最适生长所必须的一切营养物质。但更重要的是，营养物质浓度

11、与配比要合适，就是要做到培养基营养协调。,pH 最适pH：细菌7.08.0，放线菌7.58.5，酵母菌3.86.0，霉菌4.05.8。 培养基pH可以通过加入碱性或酸性化合物NaOH和HCl来调节。 通常可加入缓冲液或微溶性碳酸盐。常用由一氢与二氢磷酸盐(如K2HPO4与KH2PO4)的等摩尔溶液(pH6.8)组成的磷酸缓冲液。 此外，通常还要在培养基中加入作为指示剂的染料以指示培养基的pH变化。,3.3.2.1 根据所培养微生物的类群与营养类型区分,3.3.2 培养基的种类及其应用,3.3.2.2 根据对培养基成分的了解程度区分,3.3.2.3根据制备后培养基的物理状态区分,3.3.2.4根

12、据培养基的功能区分,细菌培养基 放细菌培养基 酵母菌培养基 霉菌培养基 自养微生物培养基 异养微生物培养基,3.3.2.1 按培养微生物与营养类型区分,合成培养基 -化学成分确定,3.3.2.2 按对培养基成分的了解程度区分,半合成培养基 -化学成分部分确定,天然培养基 -化学成分不确定,用纯化学试剂和天然物质可配制成半合成培养基，如培养真菌用的马铃薯蔗糖培养基。,天然培养基采用动植物组织或微生物细胞或它们的提取物或粗消化产物配制而成的。（牛肉膏蛋白胨培养基） 优点：所用物质取材方便，营养丰富，而且配制方便。 缺点：所用物质的成分不稳定，因而营养成分难以控制，实验结果的重复性差。,合成培养基是

13、通过顺序加入准确称量的高纯化学试剂与蒸馏水配制而成的，其所含成分(包括微量元素在内)以及它们的量都能确切地知道。（异养微生物培养基） 优点：化学成分确定并精确定量，实验的可重复性高； 缺点：配制较烦，成本较高。 应用：实验室中进行的营养、代谢、遗传育种、鉴定和生物测定等定量要求较高的研究。,呈液态的培养基为液体培养基。它广泛用于微生物学实验和生产，在实验室中主要用于生理、代谢研究和获得大量菌体。在发酵生产中极大多数发酵培养基为液体培养基。,固体培养基,3.3.2.3 按制备后培养基的物理状态区分,液体培养基,半固体培养基,如在液体培养基中加0.5%或更低浓度的琼脂就制成柔软的浆糊状半固体培养基

14、，它们用于微好氧细菌的培养或细菌运动能力的确定。,固体培养基(呈固体状态的培养基)，有加凝固剂后制成的；有直接用天然固体状物质制成的；还有在营养基质上覆上滤纸或滤膜等制成的。 常用的固体培养基是在液体培养基中加入琼脂(约2%)或明胶(5%12%)，加热到100，然后再冷却并凝固的培养基。 天然固体培养基直接用某些天然固体状物质制成，如培养真菌用麸皮、大米、玉米粉和马铃薯块培养基。取材和制备都很方便，为生产所常用。,选择培养基,3.3.2.4 按培养基的功能区分,选择培养基通过加入不防碍目的微生物生长而抑制非目的微生物生长的物质以达到选择的目的。常用抑制物质有染料和抗生素。如分离真菌用的马丁氏培

15、养基中加有抑制细菌生长的孟加拉红、链霉素和金霉素等。 选择培养基也可通过在培养基中加入目的微生物特别需要的营养物质而使它们加富以达到选择目的。这种选择培养基就是加富培养基。用于加富的营养物质通常是碳源和氮源，例如富集纤维素分解菌选用的纤维素等。,选择压力培养基,鉴别培养基,鉴别培养基是一类在培养基中添加某种化学物质而将目的或对象微生物的菌落与同一平板上的其他微生物菌落区别开来的培养基。用于鉴别肠道杆菌中某些细菌的伊红美蓝培养基是最好的例子。,现代基因克隆技术中，基因工程的载体上常带有各种遗传学标记，当这样的载体携带目的基因转入受体菌时，由于标志基因所对应的遗传表型与受体菌是互补的，因此在培养基

16、中施加合适的选择压力，将受体菌接入这种选择压力培养基，形成菌落的受体菌就是克隆子，即基因工程目的菌，而非克隆子则不生长。遗传学标记可以是氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、红霉素抗性基因等，相应的选择压力培养基中除了加入合适的营养成分外，再加入氨苄青霉素、四环素、红霉素等。,伊红美蓝培养基中的伊红和美蓝的作用： 鉴别染色，伊红是一种红色酸性染料，美蓝是一种蓝色碱性染料。大肠杆菌能强烈分解乳糖产生大量有机酸，结果与两种染料结合形成深紫色菌落。由于伊红还发出略呈绿色的荧光，因此在反射光下可以看到深紫色菌落表面有绿色金属闪光。而肠道内的沙门氏菌和志贺氏菌不发酵乳糖，所以形成无色菌落。这样就可以将无害

17、的大肠杆菌与致病的沙门氏菌和志贺氏菌区别开来。 抑制某些细菌(革兰氏阳性细菌与一些难以培养的革兰氏阴性细菌)生长的作用。此外，这两种染料在pH值低时结合形成沉淀，可起产酸指示剂的作用。 伊红美蓝培养基在饮用水、牛乳的细菌学检查以及遗传学研究上有着重要的用途。,3.4 培养基设计原理与优化方法,3.4.1 培养基的设计原理,菌体的同化能力,培养基对菌体代谢的阻遏与诱导影响,碳氮比对菌体代谢调节的重要性,pH值对不同菌体代谢的影响,有些微生物由于水解酶系的缺乏只能够利用简单的物质，而有些微生物则可以利用较为复杂的物质。因而在考虑培养成分选择的时候，必须充分考虑菌种的同化能力，从而保证所选用的培养基

18、成分是微生物能够利用的。 在选取用淀粉、黄豆饼粉这类原料作为培养基时，必须考虑微生物是否具备分泌胞外淀粉酶和蛋白酶的能力。 葡萄糖是几乎所有的微生物都能利用的碳源，因此在培养基选择时一般被优先考虑，但工业上如果直接选用葡萄糖作为碳源，成本相对较高，一般采用淀粉水解糖。在工业生产上，将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的糖化，所得的糖液称为淀粉水解糖液。,菌体的同化能力,谷氨酸发酵生产中水解糖液的质量指标,不同糖化工艺所得糖液质量比较,培养基对菌体代谢的阻遏与诱导的影响,葡萄糖效应，亦“葡萄糖分解阻遏作用” ，是指当菌种利用葡萄糖时产生的分解代谢产物会阻遏或抑制某些产物合成所需的酶系的形成或酶的活性

19、的作用。,碳源对地衣芽孢杆菌和黑曲霉生长和产酶的影响,碳氮比对菌体代谢调节的重要性,培养基中碳氮比对微生物生长繁殖和产物合成的影响极为显著。氮源过多，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累；氮源不足，则菌体繁殖量少，从而影响产量。碳源过多则容易形成较低的pH；若碳源不足则容易引起菌体的衰老和自溶。 微生物在不同的生长阶段对碳氮比的最适要求 也不一样。一般来讲，因为碳源既作为碳骨架参与菌体和产物的合成又作为生命过程中的能源，所以比例要求比氮源高。,pH值对不同菌体代谢的影响,微生物的生长和代谢除了需要适宜的营养环境外，其他环境因子也应处于适宜的状态。其中pH就是极为重要的环境因子。 合理配制培养基是保证发酵过程中pH能满足工艺要求的决定因素之一。因而在选取