lhq 动物细胞培养和核移植技术.ppt

1、植物细胞工程常用的技术手段有哪些？,那么动物细胞常用的技术手段 呢？,回忆,畅想,植物组织培养, 植物体细胞杂交,问题探讨,动物细胞工程：,动物细胞培养、动物细胞核移植、 动物细胞融合、生产单克隆抗体等,动物细胞培养技术是其他动物细胞工程技术的基础,从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后，放在适宜的培养基中，让这些细胞生长和增殖。,原理：细胞增殖,动物细胞培养,动物细胞培养的过程:,动物胚胎或幼龄动物的组织、器官,细胞悬浮液,10代细胞,传代培养,无限传代,单个细胞,加培养液,（分解弹性纤维）,过程：,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性

2、和韧性的组织和器官。,接触抑制：细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。,接触抑制,动物细胞生长特性,部分细胞突变，获得不死性，向癌细胞方向发展，糖蛋白减少。,细胞株：原代细胞一般传至10代左右细胞生长停滞，大部分细胞衰老死亡，少数细胞存活到4050代，这种传代细胞为细胞株。 细胞系：细胞株传代至50代后又出现细胞生长停滞状态，只有部分细胞由于遗传物质的改变，使其在培养条件下可以无限制传代，这种传代细胞为细胞系。 细胞株和细胞系的区别： 细胞系的遗传物质改变，具有癌细胞的特点，失去接触抑制，容易传代培养。,解答概

3、念,原代培养：从机体取出后立即培养的细胞为原代细胞。培养的第1代细胞与传10代以内的细胞称为原代细胞培养。 传代培养：将原代细胞从培养瓶中取出，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中继续培养，称为传代培养。,解答概念,1、为什么要对取出的动物组织进行处理，使细胞分散？,分散的单个细胞容易摄取所需的营养，排出代谢废物；而用大块组织培养时，内部细胞的营养供应和代谢废物的排出都较困难。,聚焦一、动物细胞培养过程,动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维、胶原蛋白等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。,2、进行细胞培养是用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么？用胃

4、蛋白酶处理行吗？,胰蛋白酶活性在pH 7.28.4之间最高，而胃蛋白酶的最适pH在2左右；传代培养的比较合适的pH在7.27.4之间。,3、用胰蛋白酶对动物组织进行处理是因为细胞间的物质主要是什么？用胃蛋白酶可以吗？,细胞间的物质主要是蛋白质（胶原纤维）。 胃蛋白酶作用的适宜pH约为2，当pH大于6时，胃蛋白酶就会失去活性。胰蛋白酶作用的适宜环境pH为7.28.4。多数动物细胞培养的适宜pH为7.27.4。,聚焦一、动物细胞培养过程,4、胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？,胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时

5、间。,聚焦一、动物细胞培养过程,体外培养细胞时需要提供哪些物质？如何才能保证类似于内环境的营养环境？培养基应是液态还是固态？,充足的营养、适宜的温度、pH和气体环境。加入动物血清。培养基应是液态。,1、无菌、无毒的环境 （添加一定量的抗生素，定期更换培养液） 2、营养 （葡萄糖、氨基酸、无机盐、微量元素、动物血清、血浆等。） 3、温度和PH 36.5 +0.5度 ；PH为7.2-7.4。 4、气体环境： O2和CO2（95%空气和5% CO2 ）,补充合成培养基中缺乏的物质,动物细胞培养条件,思考：动物血清的作用？,主要是：提供有利于细胞生长增殖所需的激素、生长因子或提供合成培养基所缺乏的营养

6、物质等。,保证细胞顺利的生长增殖,（1）生产蛋白质生物制品：病毒疫苗、干扰素、单克隆抗体等。 （2）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。 （3）用于检测有毒物质 （4）用于生理、病理、药理等方面的研究，为治疗和预防疾病提供理论依据,动物细胞培养技术的应用,2、为什么选用动物胚胎或幼龄个体的器官或组织做动物细胞培养材料？,1、动物细胞培养液的主要成分是什么？较植物组培培养基有何独特之处？,3、为什么培养前要将组织细胞分散成单个细胞？,4、动物细胞培养能否像绿色植物组织培养那样最终培养成新个体？,主要成分：葡萄糖、氨基酸、无机盐、维生素和动物血清等。 独特之处有：1、液体培养基 2、成分中有动物血清

7、等,因为这些组织或器官上的细胞生命力旺盛，分裂能力强,成块组织不利培养，分散了做成细胞悬浮液利于培养,不能，动物细胞培养只能使细胞数目增多，不能发育成新的动物个体,练一练,细胞的全能性,细胞株、细胞系,植物体或组织,培养结果,快速繁殖、培育无病毒植株等,培养目的,葡萄糖、动物血清,蔗糖、植物激素,培养基特有成分,液体培养基,固体培养基,培养基性质,细胞增殖,原理,动物细胞培养,植物组织培养,比较项目,试一试,动物细胞特点？ 分化潜能变窄：随着细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能变窄，这是指整体细胞而言。 细胞核仍具有全能性：细胞核，它含有保持物种遗传性所需的全套基因，而且并没有因细胞分化

8、而丢失基因，因此高度分化细胞的细胞核仍具有全能性,想一想,根据动物细胞核仍具有全能性的特点,怎样将动物细胞的全能性表达?,再想一想,利用动物体细胞核移植技术,2.动物细胞核移植技术和克隆动物,1、概念：将动物的一个细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵（母）细胞中，使其重组并发育成为一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体（克隆动物）。,2.1 动物细胞核移植：,克隆：指从一个共同的祖先，通过无性繁殖的方法产生出来的一群遗传特性相同的DNA分子、细胞或者个体。,细胞分化程度低，恢复 全能性容易,细胞分化程度高，恢复 全能性不容易,2、分类,1.高产奶牛的培育过程,2.2体细胞核移植的过程：,高

9、产奶牛供体细胞,去核卵母细胞,重组细胞,电刺 激融合,早期胚胎,胚胎移植,代孕母牛,妊娠、出生,注 入,理化方法,供体细胞（供核）,细胞培养,体细胞,卵巢卵母细胞（M中期：供质）,去核,无核卵母细胞,注入,细胞融合,重组细胞,构建重组胚胎,胚胎移植,代孕母体,生出与供体奶牛遗传基础相同的犊牛,归纳: 1.共分成两大阶段：核移植和胚胎移植 2.取卵细胞作受体细胞的原因是:它是最大的细胞,易操作,它发育可直接表达性状 3.严格来说新个体有卵巢母细胞的细胞质所以有两个亲本的性状,核移植过程,2.2体细胞核移植的过程：,2、多莉羊的培育过程,多莉羊的培育过程,无性生殖,1、对比多莉羊和课本高产奶牛的克

10、隆过程，找出操作过程的不同点？,思考：,多莉克隆过程的受体细胞是去核卵细胞，而高产奶牛的克隆过程的受体细胞是去核卵母细胞；多莉克隆过程是将供体细胞核注入受体细胞，而高产奶牛的克隆过程是将供体细胞注入受体细胞。,2、你认为上述哪一种措施更科学？并说明理由？,卵母细胞当中的控制细胞分裂和分化的细胞周期蛋白含量、活性比卵细胞中的高，用它作受体细胞更容易成功。,将供体细胞注入去核受体细胞，使克隆动物更像供体动物，操作也方便。,讨论：,1.在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，为什么必须先去掉受体卵母细胞的核？,为使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要利用价值的动物提供的体细胞。,培养的动物细胞

11、一般当传代至1050代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持正常的二倍体核型。,2.用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，想一想，这是为什么？,3.你认为用上述体细胞核移植方法生产的克隆动物，是对体细胞供体动物进行了100%的复制吗？为什么？,绝大部分DNA来自于供体细胞核，但其核外还有少量的DNA，即线粒体中的DNA是来自于受体卵母细胞。,此外，即便动物的遗传基础完全相同，但动物的一些行为、习性的形成与所处环境有很大关系，核供体动物生活的环境与克隆动物所生活的环境不会完全相同，其形成的行为、习性也不可能和核供体动物完全相同

12、，从这一角度看，克隆动物不会是核供体动物100%的复制。,2.体细胞核移植技术的应用前景,克隆动物的研究意义,1.克隆动物作为生物反应器，生产医用蛋白 2.改良动物品种 3.治疗人类疾病，作为供体 4.保护濒危动物,体细胞核移植技术存在的问题,1.许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷，如体型过大，异常肥胖，发育困难，免疫失调等。 2.成功率非常低及克隆动物食品的安全性问题。,知识结构,动物细胞培养和核移植技术,动物细胞培养,细胞培养的应用和概念,细胞培养的过程,细胞培养的条件,细胞培养技术的应用,动物体细胞核移植 技术和克隆动物,核移植技术和克隆动物的概念,体细胞核移植技术的过程,体细胞核移植技术

13、的应用前景,体细胞核移植技术存在的问题,1、在动物细胞培养过程中遗传物质发生改变的细胞（） A细胞系 B细胞株 C原代细胞 D传代细胞,2、动物细胞工程技术的基础是 - （ ） A.动物细胞融合 B.单克隆抗体 C.胚胎移植 D.动物细胞培养,A,D,3.动物细胞培养与植物细胞培养的重要区别在于-（ ） A.培养基不同； B.动物细胞培养不需要在无菌条件下进行； C.动物细胞可以传代培养，而植物细胞不能； D.动物细胞能够大量培养，而植物细胞只能培 养成植株。,A,教学反馈,1、幼龄与老龄动物的组织细胞比较，分化程度低的与分化程度高的组织细胞比较，哪一种更易于培养？思考一下，这是什么道理？,一

14、般来说幼年动物的组织细胞比老年动物的组织细胞易于培养。同样，组织细胞的分化程度越低，则增殖能力越强，所以更容易培养,思考题,思考与探究,2.动物细胞培养要经过脱分化的过程吗？ 为什么？,动物细胞培养不需经过脱分化过程。因高度分化的动物细胞发育潜能变窄，失去了发育成完整个体的能力，所以，动物细胞也就没有类似植物组织或细胞培养时的脱分化过程了。要想使培养的动物细胞定向分化，通常采用定向诱导动物干细胞，使其分化成所需要的组织或器官。,3.1997年，美国威斯康星州的一个奶牛场有一头名叫卢辛达（Lucinda）的奶牛，年产奶量为30.8 t，创造了世界奶牛产奶量最高新纪录。目前世界各国高产奶牛场奶牛，

15、年平均产奶量一般为十几吨，而我国奶牛产奶量年平均水平仅为34 t。 （1）能利用体细胞核移植技术克隆高产奶牛卢辛达吗？请说明理由。,可以。卢辛达的产奶量很高，有高产奶的遗传基础，利用卢辛达的体细胞克隆的奶牛其遗传物质基本上全部来自该奶牛，其克隆牛具有高产的遗传基础，如果精心培育和饲养，有可能在世界范围内推广，克隆牛再与高产的公牛自然繁殖，可得到很多高产的后代，从而加快奶牛改良进程。,该克隆牛不能无限制地推广，其数量不宜过多，尤其是在小范围内不能无限的繁殖，以避免奶牛群出现近亲繁殖而引起种质衰退。,（2）如果将克隆高产奶牛卢辛达的任务交给你，你将如何对它进行克隆？,从卢辛达耳朵（也可用别的组织、

16、器官，耳朵在活体上容易取）上剪取一小块组织，在体外培养获得该组织（如软骨组织）的细胞。从屠宰场取废弃的牛卵巢，抽取卵母细胞体外培养成熟。用显微针去除卵母细胞的核，再将耳细胞注入卵母细胞，用电刺激方法使卵母细胞与体细胞融合，这时供体核就进入了受体卵母细胞，再用电刺激或化学物质激活注入了体细胞核的卵母细胞，使其完成减数分裂和发育过程。核移植胚胎在体外短时间培养后，挑选正常卵裂的胚胎植入经同期发情处理的受体母牛体内。,4.体细胞核移植技术在研究和应用上还存在什么问题？请你查阅资料，了解这方面的前沿动态。,研究方面：克隆动物基因组重新编程的机制尚不清楚，克隆技术效率低，克隆动物畸形率高、死亡率高、易出

17、现早衰等问题。这些问题尚在研究中。 应用上：生产克隆动物费用昂贵，距大规模应用还有一定距离。,教学参考,1.进行动物细胞传代培养时用胰蛋白酶分散细胞，说明细胞间的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？ 细胞间的成分主要是蛋白质。胃蛋白酶适宜的PH约为2，当PH6时，胃蛋白酶就会失去活性，而胰蛋白酶作用的适宜环境PH为7.2-8.4，多数动物细胞培养的适宜PH为7.2-7.4，胃蛋白酶在此环境中没有活性。胰蛋白酶在此环境中活性较高，因此胰蛋白酶适宜用于细胞培养时的消化。 2.胰蛋白酶真的不会把细胞消化掉吗？为什么？ 胰蛋白酶除了可以消化细胞间的蛋白质外，长时间的作用也会消化细胞膜蛋白，对细胞有损伤作用，因此必须控制好胰蛋白酶的消化时间。 3.单层细胞培养：1957年，科学家采用胰蛋白酶消化处理和应用液体培养基的方法，获得了单层细胞培养。单层培养法的出现，对细胞培养的发展起了很大的推动作用。,4.为什么对动物细胞进行培养时通常要添加血清？ 血清中含有蛋白质、氨基酸、葡萄糖、激素等，其中蛋白质为白蛋白和球蛋白；氨基酸有多种，是细胞合成蛋白质的基本成分，有些动物细胞不能合成，必须由培养液提供；激素有胰岛素、生长激素等促进细胞