双向电泳的操作.ppt

1、双向电泳的操作,2007-7-4,步骤,样品制备（Sample preparation） 固相pH 梯度胶条的水化（IPG strip rehydration） 第一向等电聚焦（IEF） 第一向胶条的平衡（ IPG strip equilibration） 第二向SDS 电泳（SDS-PAGE） 检测染色（Detection/Staining） 蛋白点的挖取，收集 质谱分析,总的策略,参考资料, 蛋白质组学导论-生物学的新工具 (2005) D.C. 利布莱尔 著 蛋白质化学与蛋白质组学 (2004) 夏其昌 编著,一般性原则,尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失

2、 减少对蛋白质的人为修饰 破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态,样品制备需要的试剂,离液剂(chaotropes): 尿素（Urea）和硫脲（thiourea） 表面活性剂（sufactants）也称去垢剂： NP-40、TritonX -100 等非离子去垢剂 CHAPS 与Zwittergent 系列等双性离子去垢剂 还原剂（reducing agents ） 二硫苏糖醇（DTT） 二硫赤藓糖醇（DTE） 磷酸三丁酯（TBP） 选择性的加入 Tris-base 蛋白酶抑制剂（ 如EDTA 、Pefabloc protease inhibitor 、PMSF or

3、 Protease inhibitor cocktails ） 核酸酶,影响蛋白质可溶性和2DE 重复性的物质,核酸 超声或核酸酶处理 脂 多糖 超速离心除去 盐类小分子 透析可以降低盐浓度，但时间太长 采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。,常用裂解液,Urea Thiourea CHAPS DTT Pharmalyte pH 3-10 Tris-Base Pefabloc protease inhibitor 1% SDS,样品制备程序,培养细胞（culture cell）样品处理方法 （1） 培养细胞的收集； （2） 用磷酸缓冲液（PBS）洗细胞3 次（室温，1000

4、g， 各2min）； （3） 将细胞分装到1.5ml Eppendof 管中，吸干残留的PBS； （4） 加入裂解缓冲液（1.5x106 个细胞大约加入100L 裂解液），在室温振荡1h，使其充分溶解； （5） 4，40,000g，离心1h； （6） 吸取上清并用Brandford 法定量蛋白，然后分装至Eppendof 管里保存在-78 备用。,组织样品处理方法 三氯醋酸丙酮沉淀法（TCA/acetone precipitation） 超速离心法,BACK,IPG 胶条的水化,加样品水化 不加样品水化,加样品水化,加样品水化,BACK,IEF,限流 50uA 200V 1hr 500V 1h

5、r 1000V 1hr 8000V 30min gradient 8000V 5hr (40000Vh) 500V 维持,BACK,IPG strip equilibration,BACK,分装40ml 贮存于-20 这是一个贮存液。用之前在加1%DTT 或者2.5%碘乙酰胺。,第二向SDS 电泳（SDS-PAGE）,BACK,2-DE 胶蛋白质点的检测,1）考马斯亮兰染色法； 2) 银染法； 3）负染法； 4）荧光染色法； 5）放射性同位素标记法。,考马斯亮兰染色法,经典的考马斯亮兰染色（R-250） 局限：灵敏度低（1g protein/spot） Neuhoff 胶体考染法 优点：背景低，灵敏度高，可达到200ng protein/spot 热考马斯亮兰染色及二次染色法 .,银染法,银染的方法种类很多，目前有文献报道的就有100 多种。但是其准确的染色机制还不是特别的清楚。大致的原理是银离子在碱性pH 环境下被还原成金属银，沉淀在蛋白质的表面上而显色。 由于银染的灵敏度很高，可染出胶上低于1 ng/蛋白质