实验六-细菌的生理生化试验.ppt

1、2020/8/26,实验六 细菌的生理生化试验,2020/8/26,一、 目的 1、了解细菌鉴定中常用的生理生化试验反应原理 。2、掌握细菌生理生化试验的方法。,2020/8/26,二、原理,由于细菌特有的单细胞原核生物的特性，各种微生物在代谢类型上表现了很大的差异。不同细菌分解、利用糖类、脂肪类和蛋白类物质的能力不同，所以其发酵的类型和产物也不相同，也就是说，不同微生物具有不同的酶系统。即使在分子生物学技术和手段不断发展的今天，细菌的生理生化反应在菌株的分类鉴定中仍有很大作用。,2020/8/26,三、材料,1菌种 大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）、产气肠杆菌、沙门氏菌的斜面菌

2、种 。 2培养基 葡萄糖发酵培养基、乳糖发酵培养基、葡萄糖蛋白胨水培养基、蛋白胨水培养基、三糖铁琼脂斜面等。,2020/8/26,3试剂 5%的-萘酚溶液、 40KOH溶液、甲基红试剂、吲哚试剂、乙醚。 4器具 超净工作台、恒温培养箱、高压灭菌锅、试管、移液管、接种环等。,2020/8/26,四、流程,糖类发酵试验 V-P试验M.R试验吲哚试验 硫化氢试验三糖铁 （TSI）琼脂试验,2020/8/26,五、步骤,(一)糖类发酵试验 1目的 了解不同细菌分解利用糖的能力及实验原理，并掌握其操作方法。,2020/8/26,2原理 可根据细菌分解利用糖能力的差异表现出是否产酸产气作为鉴定菌种的依据。

3、是否产酸，可在糖发酵培养基中加入指示剂溴甲酚紫（即B.C.P指示剂，其pH在5.2以下呈黄色，pH在6.8以上呈紫色），经培养后根据指示剂的颜色变化来判断。是否产气，可在发酵培养基中放入倒置杜氏小管观察是否产生气泡来判断。,2020/8/26,3材料 3.2菌种 大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）、产气肠杆菌（Enterobacteraerogenes）、沙门氏菌的斜面菌种 3.培养基 葡萄糖和乳糖发酵培养液试管,2020/8/26,流程 发酵液试管标记接种培养观察记录,2020/8/26,5步骤 5.1试管标记 取分别装有葡萄糖和乳糖发酵培养液试管各4支，每种糖发酵试管中均分别标

4、记大肠杆菌、产气肠杆菌、沙门氏菌和空白对照。,2020/8/26,5.2接种 以无菌操作分别接种少量菌苔至以上各相应试管中，每种糖发酵培养液的空白对照均不接菌。置37恒温箱中培养，分别在培养24h、48h、和72h观察结果。,2020/8/26,2020/8/26,2020/8/26,5.3观察记录 与对照管比较，若接种培养液保持原有颜色，其反应结果为阴性，表明该菌不能利用该种糖，记录用“”表示；如培养液呈黄色，反应结果为阳性，表明该菌能分解该种糖产酸，记录用“”表示。培养液中的杜氏小管内有气泡为阳性反应，表明该菌分解糖能产酸并产气，记录用“”表示；如杜氏小管内没有气泡为阴性反应，记录用“”表

5、示。,2020/8/26,(二)、乙酰甲基甲醇试验(VP试验) 1.目的 检测细菌能否利用葡萄糖产生非酸性或中性末端产物的能力。了解鉴别不同肠杆菌科各菌属的乙酰甲基甲醇试验原理，并掌握其操作方法。,2020/8/26,2原理,葡萄糖 丙酮酸 乙酰甲基甲醇 二乙酰 与胍基生成红色化合物 某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸缩合，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在强碱环境下，被空气中氧氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基生成红色化合物，称VP（+）反应。,2020/8/26,3材料,(1)、菌种 大肠埃希氏菌、产气肠杆菌、沙门氏菌的斜面菌种 (2)、培养基 葡萄糖蛋白胨水培养基

6、(3)、试剂 V-P指试剂,2020/8/26,流程,培养液试管标记接种培养观察记录,2020/8/26,5步骤,（1）、标记试管 取4支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、沙门氏菌和空白对照。,2020/8/26,（2）、接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37恒温箱中，培养4872h。,2020/8/26,（3）、观察记录 取出以上试管，先加甲液（6%的-萘酚溶液）0.5毫升,再加乙液（40KOH溶液）0.5毫升,充分混匀,静置15min后，若培养液呈红色者，记录为V.P.试验阳性反应（用“”表示）；若不呈红色，记录为V.P.试

7、验阴性反应（用“”表示）。1小时后可出现假阳性。,2020/8/26,2020/8/26,（三）甲基红试验（M.R.试验）,1、目的 检测细菌能否分解葡萄糖产生有机酸的能力。了解鉴别肠杆菌科各菌属的甲基红试验原理，并掌握其操作方法。,2020/8/26,2、原理 肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖，在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。,2020/8/26,3、材料 （1）、菌种 大肠埃希氏菌（Escherichiacoli）、产气肠杆菌、沙门氏菌的斜面菌种 （2）、培

8、养基 葡萄糖蛋白胨水培养基,2020/8/26,4流程 培养液试管标记接种培养指示剂观察记录,2020/8/26,（1）、标记试管 取4支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、沙门氏菌和空白对照。,5、步骤,2020/8/26,（2）、接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37恒温箱中，培养4872h。,2020/8/26,（3）、观察记录 取出以上试管，各加入56滴甲基红指示剂，注意沿管壁加入，仔细观察培养液上层，若培养液上层变成红色，即为阳性反应；若仍呈黄色，则为阴性反应，分别用“”或“”表示。 注意：甲基红指示剂不能加太多，以免出

9、现假阳性。,2020/8/26,甲基红（Methyl Red）试验结果,2020/8/26,2020/8/26,（四）、靛基质（吲哚）试验,1目的 用来检测细菌能否分解色氨酸产生吲哚的能力。掌握吲哚试验(Ehrlich法)的原理和方法 。,2020/8/26,2、原理 有些细菌含有色氨酸酶，能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚(靛基质)。吲哚本身没有颜色，不能直接看见，但当加入对二甲基氨基苯甲醛试剂时，该试剂与吲哚作用，形成红色的玫瑰吲哚。,2020/8/26,3、材料 3.1菌种 大肠杆菌、产气肠杆菌、沙门氏菌 3.2 培养基 蛋白胨水培养基 3.3试剂 对二甲基氨基苯甲醛溶液、乙醚。,2020/

10、8/26,4流程 标记试管接种培养观察记录,2020/8/26,5步骤 （1）、标记试管 取4支装有葡萄糖蛋白胨培养液的试管，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、沙门氏菌和空白对照。,2020/8/26,（2）、接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管中，空白对照管不接菌，置37恒温箱中，培养4872h。,2020/8/26,（3）观察记录 在培养液中加入乙醚12ml，经充分振荡使吲哚萃取至乙醚中，静置片刻后乙醚层浮于培养液的上面，此时沿管壁缓慢加入510滴吲哚试剂（加入吲哚试剂后切勿摇动试管，以防破坏乙醚层影响结果观察），如有吲哚存在，乙醚层呈现玫瑰红色，此为吲哚试验阳性反应，否则为阴性

11、反应，阳性用“”、阴性用“”表示。,2020/8/26,6结果,2020/8/26,(五)硫化氢试验,某些能分解胱氨酸H2S与醋酸铅或硫酸亚铁 黑色（硫化铅或硫化铁）,沙门氏菌,2020/8/26,2020/8/26,（六）、三糖铁（TSI）琼脂试验,原理 本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红，底部由于是在厌氧状态下，酸类不被氧化，所以仍保持黄色。,2020/8/26,3材料 (1)、菌种 大肠埃希氏菌、产气肠杆菌杆菌、沙

12、门氏菌的斜面菌种 (2)、培养基 三糖铁琼脂斜面培养基,2020/8/26,4流程 标记试管接种培养观察记录,2020/8/26,（1）、标记试管 取4支三糖铁琼脂斜面培养基，分别标记大肠杆菌、产气肠杆菌、沙门氏菌和空白对照。,2020/8/26,（2）、接种培养 以无菌操作分别接种少量菌苔至以上相应试管先作划线分离培养，然后采用穿刺培养方法刺到试管底，空白对照管不接菌，置37恒温箱中，培养2448h。,2020/8/26,（3）观察记录 本试验可同时观察乳糖和蔗糖发酵产酸或产酸产气（变黄）；产生硫化氢（变黑）。葡萄糖被分解产酸可使斜面先变黄，但因量少，生成的少量酸，因接触空气而氧化，加之细菌利用培养基中含氮物质，生成碱性产物，故使斜面后来又变红