Dmrt基因.ppt

1、,中国林蛙Dmrt基因的克隆测序及在不同组织中的表达,选题背景 研究目的及意义 研究内容 技术路线 预期效果,选题背景,林蛙的生物学特性及经济价值 Dmrt基因及其研究进展 简并PCR,选题背景,1林蛙的生物学特性及经济价值 生物学特性 中国林蛙（Rana temporaria chensinensis）隶属于两栖纲（Amphibia）无尾目（Anura）蛙科（Ranidae）蛙亚科（Raninae）林蛙属（Rana）。 林蛙体细胞的二倍体染色体是13对，5对是大型，8对是小型，雌雄个体之间没有发现异型染色体 。 经济价值 中国林蛙俗称哈士蟆、田鸡，主要分布于我国东北及华北，可食用和药用， 是

2、一种重要的经济蛙类，由于雌性的输卵管（俗称哈士蟆油）是珍贵的药材，是滋补强壮之佳品，具有较高的经济价值，使得雌蛙的身价比雄蛙高出几倍。,选题背景,2 Dmrt基因及其研究进展 1）Dmrt基因 Dmrt基因(dsx and mab-3 related transcription factor)是指含有与果蝇dsx基因和线虫mab-3基因同源的基因。该基因有一个共同特征：即所编码的蛋白质都包含一个具有DNA结合能力的高度保守基序DM结构域，DM( Dou-blesex and Male aberrant-3 relative do-main)结构域是在果蝇的性别决定基因double-sex（Ds

3、x）编码的蛋白质中发现的,它是一个富含半肤氨酸的类似锌指的结构基序,通过锌指方式与特定的DNA序列相结合，并由此调控下游基因表达，控制着性别的分化和生殖腺的发育，参与不同个体性状的发育和器官的形成。,2）基因功能及研究进展 （1）基因功能： Dmrt基因家族的主要功能是参与性别决定与分化，参与许多组织、器官的形成及相关功能的维持。 迄今，在人类及其它动物中已克隆的Dmrt家族成员约有10个，对其功能的研究主要集中在Dmrt1Dmrt4，其中参与性别决定（dsx和mab-3与Dmrt1、Dmrt2）；参与神经系统和感觉器官的发育（Dmrt3、Dmrt4等）；参与体节发育（ Dmrt3）；参与肾、

4、鳃、骨骼肌形成和功能维持（ Dmrt2、 Dmrt3、Dmrt4）。,（2）研究进展： Dmrt1的研究进展 （）Raymond C等（1999）在XY雄性小鼠中研究发现，Dmrt1基因敲除会导致睾丸分化不完全甚至会导致生殖细胞死亡。 （）Marchand等（2000）对虹鳟鱼的研究表明，Dmrt1在精巢中特异性表达。 （） Ellegren等（2001）研究表明Dmrt1定位于Z染色体上，在鸡胚胎发育的性腺中特异表达，且精巢中表达量高于卵巢，一旦鸟类性腺分化方向确定，Dmrt1呈现为睾丸专一性表达。 （） Sreenvasulu等（2002）研究D表明Dmrt1在晰蝎发育第3天的生殖嵴中开始

5、表达，随后仅限于间充质细胞，而间充质细胞将进一步发育成精巢足细胞。,（）Kazuyuki等（2002）对虎纹蛙的研究中表明，当用MPT (male-promoting temperatur)孵化受精卵时， Dmrt1在精巢分化时专一表达，在卵巢分化时无表达，成体组织中，在精巢组织中特异性表达。 （）季代丽等（2005） 在对黑斑蛙的研究中表明：Dmrt1只在精巢中特异表达,在卵巢、眼、肠、鳃及心脏组织中无表达。 （）杨东等（2008）采用RT-PCR技术对尼罗罗非鱼不同组Dmrt1基因的表达进行了研究，结果发现，Dmrt1只在精巢中特异表达，在卵巢、眼、肠、鳃及心脏组织中无表达。,其他Dmrt

6、 基因的研究进展 （）Ottolengh等（2000）对一个46岁，XY性逆转妇女的组织进行研究表明Dmrt2基因作为发育基因，在不同的时空中发挥调控作用，使发育朝某一特定方向进行。 （）Smith CA等（2002）年的研究发现Dmrt2在鸡胚的早期尾部体节及后期的泌尿生殖系统中表达，Dmrt3在神经管发育中专一性表达，最明显时期是在E2-E3期。 （）Kim等（2003）在鼠胚胎期的脑中发现了Dmrt5表达，进一步用原位杂交发现E13.5期脑中有Dmrt5表达，同时还发现Dmrt6在大脑中也有表达，但表达水平很低。 （）Winkler C等（2004）的研究表明Dmrt2在青鳉鱼鳃中和早期

7、体节中有表达，Dmrt4在嗅觉系统中表达，其脑、眼、鳃、肾、精巢、卵巢中也有表达，但在早期性腺中无表达。,选题背景,简并PCR 简并PCR是20世纪90年代初建立的用于细胞遗传学中特异扩增DNA的技术方法，根据密码子存在的简并性设计寡核苷酸引物进行聚合酶链式反应。不需要知道要扩增DNA片段的核苷酸序列，因此该技术倍受青睐，在多个领域都有广泛的应用。 简并PCR中用的是由多条不同核苷酸序列组成的混合引物库，其基本原理就是根据氨基酸序列设计两组带有一定简并性的引物库，从不同生物物种中扩增出未知核苷酸序列的基因，简并引物库是由一组引物构成的，这些引物有很多相同碱基，在序列的好几个位置也有很多不同的碱

8、基，只有这样，才会和多种同源序列发生退火以实现PCR扩增。,设计简并PCR引物需要两个必要条件：一是两段保守的氨基酸序列或DNA序列（保守性不必为100%），保守氨基酸区段最好不要以丝氨酸、精氨酸和亮氨酸为主，二是蛋白N端序列已知，一般蛋白末端测序得到的序列足够用来引物设计。 在引物设计中，最重要的是要尽量降低引物库的简并性程度。 进行简并PCR反应的模板：DNA 、cDNA 。用加了oligo-dT的cDNA作模板容易进行简并 PCR，因为用不加的oligo-dT的cDNA作模板很容易扩增不到转录体的3最末端。,研究的目的与意义,1）通过对Dmrt基因的DM区域的克隆测序及与其他物种进行同源

9、性比对，分析其在进化上的保守性。 2）通过RT-PCR技术分析Dmrt基因在不同组织中的表达情况，分析其与中国林蛙的性别发育的相关性，进而为中国林蛙的性别控制与发育基因的研究提供必要的分子生物学手段。 。,研究内容,1）设计简并PCR引物克隆测序Dmrt基因家族的DM结构域并进行序列保守性分析。 2）取中国林蛙成体的心、脑、肝、肾、肌肉、睾丸、卵巢组织提取RNA，进行RT-PCR技术分析Dmrt基因在不同组织中的表达情况，分析与中国林蛙的性别及发育的相关性。,技术路线,1）克隆测序 基因组DNA的提取 设计简并PCR引物 中国林蛙雌雄个体分开进行PCR扩增 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR产物克隆测序 2）进行RT-PCR分析,试验研究预期效果,对黑龙江