实验八 酵母核糖核酸的分离及组分鉴定 、DNA的Tm值测定.ppt

1、实验八 酵母核糖核酸的分离及核酸组分鉴定,一、目的,了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。,二、原理,酵母核酸中RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀，由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱，嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。,三、操作,1、提取：将2 g酵母悬浮于10ml 10%NacL溶液中（50ml锥形瓶），经膨胀、摇匀后置100沸水浴上加热30min后，冷却。离心（3,500r/min）10min,将预冷的 酸性乙醇溶液以等体积倾入上清液 中。注意要 边搅拌一边倾入。待核糖核

2、酸沉淀完全后，离心（3，000r/min）5min。 得到沉淀物用适量的0.5mol/L碳酸氢钠溶液溶解后，再用SC溶液定容至10ml。,2、 DNA和RNA成分鉴定： 1）、嘌呤碱 取两支小试管，分别加入0.5mlDNA和RNA样品溶液，然后在每支试管中加入0.5ml 10%氨水和0.5ml 0.1mol/LAgNO3混匀后，观察沉淀物及其颜色的变化,2）、核糖 取两支试管分别加入DNA和RNA样品溶液0.5ml、二苯胺溶液0.5ml。放沸水浴中10min。注意溶液是否变成蓝色，说明该方法的专一性。 3）、磷酸：取两支试管，加入DNA 和RNA样品溶液0.5ml和定磷试剂0.5ml。在水浴中

3、加热，观察溶液是否变成蓝色，说明磷酸是否存在，两支试管的颜色的深浅度为什么有差异。,四、思考题,p43页3、6、7,实验九 DNA Tm值的测定,一、目的,正确理解DNA 的Tm值的定义及测定Tm值的意义； 掌握DNA Tm值的测定方法； 了解DNA变性、复性的机理与条件。,二、原理,当DNA在稀盐溶液中加热到80-100时，双螺旋结构即发生解体，两链分开，形成无规则线团。与此同时发生了一系列理化性质的变化，其中260nm的消光值增高（增色效应）；粘度降低；浮力密度降低等。DNA的这些变化是属于爆发式的，变性作用发生在很窄的温度范围内。通常把DNA的双螺旋结构失去一半时的温度称为该DNA的熔点

4、或熔解温度（melting temperature）,用Tm表示，DNA的Tm值一般在70-85之间。变性后的DNA在温度降低的过程中得以复性，A260nm值再次下降到接近自然状态的消光值。,DNA的Tm值的影响因素: DNA的均一性 均一性越高的样品，熔解的温度范围越窄； G-C含量 Tm值是随G-C含量增高而增高的。由Tm值可推算出G-C的含量。其经验公式为 （G-C）%=（Tm-69.3）2.44； 介质中离子强度 一般离子强度较低的介质中DNA熔解温度较低，熔解温度也较宽。,三、操作步骤,1、将8个恒温水浴箱，调节温度为50、60、70、75、80、85、90、95、100 2、 取1

5、2支有盖的大试管，各管加入3ml DNA溶液，盖上帽子，在各水浴箱中分别放一支，在100水浴锅中放三支，另有一支放在室温下，保温15min后迅速取出，并保持温度去测定各管（10管）DNA溶液的A260nm。以10.15mol/LNaCl-0.015mol/L柠檬酸钠缓冲液pH7.0,为对照液。 3、将在100保温15mon后的另两支装有DNA溶液的试管取出，分别放在50和室温下0.5h以上，再在260nm波长下测定消光值。,四、结果与分析,1、计算各温度下的A260nm（t） /A260nm（25），并以此比值对温度作图（见图十三），连接各点成平滑曲线，测定出消光值增加的中点，此即Tm。计算G-C%含量。 公式为：（G-C）%=（Tm-69.3）2.44