离心技术.ppt

1、第五章 离心技术,内容,离心技术简介 离心技术原理 离心机分类 离心机转头种类 离心方法介绍及举例,离心技术简介,离心（centrifuge） 离心是利用旋转运动的离心力以及物质的沉降系数或浮力密度的差异进行分离、浓缩和提纯的一种方法。 离心技术是根据物质在离心场中不同的行为来分离物质的。,离心分离是制备生物样品广泛应用的重要手段，可以分离 活体生物（细胞、微生物、病毒） 细胞器（细胞核、细胞膜、线粒体） 生物大分子（核酸、蛋白质、酶、多聚物） 小分子聚合物,1911-1912年，开始生产和使用低速（3,000 rpm以下）的商品化台式离心机；,离心技术的发展,1923-1926年，瑞典UPP

2、SALA大学Svedberg等科学家试制了世界上第一台试验型超速离心机（45,000 rpm）。1926年测定了马血红蛋白的分子量；,1929年，Lamm完成了沉降方程。计算了沉降速度。定义了沉降系数； 1940 年，Svedberg与Pederson出版了世界上第一本有关离心技术的专著； 1943年，Pickels研制成现代固定角式离心转子；,1951年，Brakke在差速离心的基础上发展了速率区带离心法。Kahler研制成功甩平转子； 1955年，Anderson发明了区带转头，并用区带离心法首次证明了DNA双螺旋结构半保留复制的假说； 1955年以后，开始了超速、高速、低速大容量离心机以

3、及分析用超速离心机的商品化生产；,最主要的离心机制造商 美国：Beckman; Sorvall; IEC 日本：HITACHI KOKI; Kubota 英国：MSE 德国：Heraeus; Eppendorf; Sigma; Hettich; Hermle 瑞士：Kontron 法国：Joan,1957-1959年，Meselson、Duve等开发了等密度离心法。 19641966年，Anderson等开始建立转子区带离心技术并开发了低、高、超速区带转头。 1975年，垂直管转子被开发并用于Dupont-Sorvall油透平驱动的超速离心机。 1981年，美国Beckman公司开发的用于细胞

4、离心纯化的“淘洗”转头供应市场。 ,离心技术原理,当一个粒子(生物大分子或细胞器)在高速旋转下受到离心力作用时， Fc=m2r 其中：m沉降粒子的有效质量； 粒子旋转的角速度； r粒子的旋转半径(cm),在离心技术中，离心力大小常用重力加速度来衡量 G2r=42 N2r/3600 相对离心力（relative centrifugal force） RCF=G/g=1.1210-5 N2r 其中： 角速度，单位是弧度/秒 r旋转力臂半径，单位是cm N每分钟的转数，单位是r/min,从外界因素看，颗粒的沉降速度取决于离心机的转速及其自身与中心轴的距离。,只要给出旋转半径r，则RCF和rpm之间可

5、以相互换算。 由于转头的形状及结构的差异，使每台离心机的离心管，从管口至管底的各点与旋转轴之间的距离是不一样的，所以在计算时规定旋转半径均用平均半径“rav”代替： rav=(rmin+rmax)/2,颗粒在介质中的沉降速度 = d2 ( - ) g / 18 Stokes方程 其中： 颗粒的沉降速度 d颗粒直径 颗粒密度 介质密度 介质的粘度,1、颗粒沉降速度与颗粒直径平方成正比，颗粒大沉降快； 2、颗粒沉降速度与颗粒和介质密度差成正比，密度之差越大沉降越快；,沉降系数（sedimentation coefficient，S） 颗粒在单位离心力作用下的沉降速度称为该颗粒的沉降系数，把10-1

6、3秒作为一个单位，称为斯维得贝格单位，或称沉降系数单位，用S表示。,S ,式中：S沉降系数 沉降速度 r旋转半径 介质粘度,d颗粒直径 样品中颗粒的密度 溶剂的密度,例如： 溶菌酶的沉降系数为2.1510-13 s，通常叫做2.15 S，过氧化氢酶的沉降系数为11.3510-13 s，就称11.35 S。大肠杆菌核蛋白体是70 S，由两个亚基组成，用超离心方法测其沉降系数分别为30 S和50 S。,蛋白质的沉降系数一般在1-200 S之间。,某些生物样品的沉降系数、相对离心力和转速的范围,为了使沉降系数只表示样品本身的物理量，规定： 在20的纯水中所测得样品的沉降系数用S20,w表示。 由于许

7、多生物大分子的沉降系数表现了浓度的依赖性，所以用浓度接近零的外推值来表示生物大分子的沉降系数，即 S020,w。它是一个常数。,沉降系数与分子质量之间关系,M,RTS20,w,D20,W(1),其中：M物质分子质量； D20,w物质颗粒在20水中的扩散系数； T绝对温度； R气体常数，8.186 J(K/mol)； S沉降系数； 溶剂密度； 偏微比容，颗粒密度的倒数。,几种蛋白质的沉降系数和分子质量,离心机分类,离 心 机,1、普通离心机 最大转速6000rpm左右，最大相对离心力近6000g，容量为几十毫升至几升，分离形式是固液沉降分离，转子有角式和外摆式，其转速不能严格控制，通常不带冷冻系

8、统，于室温下操作。 用于收集易沉降的大颗粒物质，如红血球、酵母细胞等。,2、高速冷冻离心机 最大转速为200025000 rpm，最大相对离心力为89000 g，最大容量可达3升，分离形式也是固液沉降分离，转头配有各种角式转头、水平式转头、区带转头、垂直转头和大容量连续流动式转头、一般都有制冷系统，转速、温度和时间都可以严格准确地控制，并有指针或数字显示。 通常用于微生物菌体、细胞碎片、大细胞器、硫酸铵沉淀和免疫沉淀物等的分离纯化工作，但不能有效地沉降病毒、小细胞器(如核蛋白体)或单个分子。,3、超速离心机 转速可达5000080000 rpm，相对离心力最大可达510000 g，离心容量由几

9、十毫升至2升，分离的形式是差速沉降分离和密度梯度区带分离，离心管平衡允许的误差要小于0.1克。 超速离心机能使过去仅仅在电子显微镜下观察到的亚细胞器得到分级分离，还可以分离病毒、核酸、蛋白质和多糖等。,转速：6000 rpm 离心力：5200 g 转子：水平转头 容积：3 L （4750 mL） 台式，落地式,Beckman GP,转速：6000 rpm 离心力：5200 g 转子：水平转头, 固定角转头 容积：3 L （4750 mL） 制冷式，非制冷式,Eppendorf 5810 centrifuge,转速：14,000 rpm 离心力：20,800 g 转子：水平转头（4400 mL）

10、， 固定角转头（301.5 mL）,小型高速离心机,Avanti-J 高速离心机,Beckman-Coulter,Optima-L-XP超速离心机,5 mm 样品水平液面差,角转头 （angle rotor） 甩平转头（swinging bucket rotor） 垂直转头（vertical tube rotor） 近垂直转头（near vertical tube rotor） 区带转头（zonal rotor） 连续流转头（continuous flow rotor）,离心机转头种类,各种转头特点,角转头（angle rotor）,角转头：离心管放置的位置与转头的旋转轴之间成一个固定角度，通

11、常在14-40之间。 承受的最大离心速度在100,000 r/min，最大离心力可达800,000 g。 适用于差速离心，也可用于等密度离心。 特点：容量大，转头内容纳的离心管多。,甩平转头（swinging bucket rotor）,甩平转头：离心管组装在转头的吊桶里，离心机处于静止状态时离心管为垂直方向，即离心管与离心轴承平行方向。离心时离心管与旋转轴垂直。 承受的最大离心速度在65,000 r/min左右，最大离心力在400,000 g。 适合于密度梯度离心，进行差速离心效果不理想。,水平转头的基本结构,600 rpm,垂直转头（vertical tube rotor）,垂直转头：是指

12、离心管与旋转轴成平行方向。当转头旋转时，离心管中的液体层改变方向，与旋转轴成垂直方向。当离心结束后，液层又随转速的降低慢慢恢复原位。 承受的最大离心速度在100, 000 r/min左右，最大离心力在700, 000g 。 比较适合速率区带离心和等密度离心，尤其适合于质粒DNA 的分离纯化，但不适合于差速离心。,垂直转头的基本结构,转头停止状态,区带转头（zonal rotor）,适用于大量样品的分离。 最大离心速度：60,000 rpm左右 最大离心力：250,000g,区带转头的基本结构,连续流转头（continuous flow rotor）,最大离心速度：32,000 rpm左右 最大

13、离心力：100,000 g,连续流转头的基本结构,举例：质粒DNA(plasmid DNA)的超速离心分离,离心管,塑料离心管：聚乙烯（PE）管，纤维素（CAB）管，聚碳酸酯（PC）管，聚丙二醇酯（PP）管等。,不锈钢离心管,沉淀离心 差速分级离心 密度梯度离心 淘洗离心 连续流离心,离心方法介绍及举例,沉淀离心是应用最广的一种离心方法，一般是指介质密度约1 g/ml，选用一种离心速度，使悬浮溶液中的悬浮颗粒在离心的作用下完全沉淀下来。 主要适宜于细菌等微生物、细胞和细胞器等生物材料（密度在1.08-1.12 g/ml左右）；病毒和染色体DNA等（密度在1.18-1.31 g/ml左右）。 沉

14、降速度与离心力和颗粒大小有关。,沉淀离心（pelleting）,沉淀离心示意图,差速分级离心（differential pelleting）,差速离心是建立在颗粒的大小、密度和形状有明显的不同，沉降系数存在较大差异的基础上进行分离的方法。 差速离心比较适用于差异比较明显的细胞或细胞器的分级分离，经过多次离心可以得到满意结果。 差速离心每次得到的沉淀物都含有极少量的小于该s值的沉淀物质。,差速离心示意图,第一步：物质A的沉降。A100沉淀时，沉淀物中有10的B和1的C。多次沉淀纯化物质A。,第二步：物质B的沉降 第三步：物质C的沉降,例：一个体积为100 mL悬浮液中有三种物质A、B、C，沉降系

15、数分别为100S、10S、1S。采用差速离心的方法分离。,差速离心法主要用于分离细胞器和病毒。 优点是：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清夜与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。 缺点是：分离效果差，不能一次得到纯颗粒；壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时，在离心管一侧会出现沉淀；颗粒被挤压，离心力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失活。,细胞器细胞核、染色体、线粒体、核糖体、多糖体、内质网、溶酶体、高尔基体、过氧化酶体、可溶性的细胞浆等（植物中还有叶绿体）。,细胞器的分离,分离方法差速离心法。 分离介质生理盐水、蔗糖、甘露醇、柠檬酸、聚乙二醇、Ficoll。,在0.25 mol/L

16、蔗糖中的100 g/L，10（W/V）的肝匀浆,1000 g离心10 min,粗制细胞核沉淀,上清液,3300 g离心10 min,粗制线粒体沉淀,上清液,16300 g离心20 min,粗制溶酶体沉淀,上清液,100000 g离心1h,粗制微粒体沉淀,上清液,大白鼠肝脏匀浆分级分离成各种亚细胞组分示意图,密度梯度离心（density gradient centrifugation）,速率区带离心（rate zonal centrifugation） 根据颗粒的不同沉降速度而分离,（区带离心） 密度梯度离心,等密度区带离心（isopycnic centrifugation） 根据颗粒密度的差异

17、进行分离,该法的优点是：分离效果好，可一次获得较纯颗粒；适应范围广，既能分离具有沉淀系数差的颗粒，又能分离有一定浮力密度的颗粒；颗粒不会积压变形，能保持颗粒活性，并防止已形成的区带由于对流而引起混合。 缺点： 离心时间较长；需要制备梯度；操作严格，不宜掌握。,速率区带离心,在速率区带离心中，梯度液设计的最大密度小于样品颗粒（各种组分）的密度。 离心前预先在离心管内装入密度梯度介质，被分离物质的样品溶液位于梯度液的上面。,离心时样品中的组分以不同的沉降速度沉降，离心时间应该控制在最重的样品沉淀之前，结束时不同的组分以纯样品带方式存在于梯度液之中。,等密度区带离心,在等密度介质中的密度范围正好包括

18、所有待分离颗粒的密度。,样品可以加在已经制好的密度梯度介质的上面，也可以与密度介质混合在一起。,离心结束后，颗粒停留在与其密度相等的介质区域内。,S ,若，则0，颗粒顺离心力方向沉降。 若=，则=0，颗粒沉降或上浮到某一位置达到平衡。 若0，颗粒逆离心力方向上浮。,密度梯度溶液,目前使用的密度梯度材料主要有： CsCl2, LiCl, RbCl，酒石酸钾钠，甘油，蔗糖，聚蔗糖等。,常使用的梯度液为5% -20% （W/V）蔗糖 离心管顶部为5%的蔗糖，密度1.018 g/mL； 离心管底部为20%的蔗糖，密度为1.077 g/mL。,梯度材料的选择,1、正确选择密度梯度的范围。 蔗糖20时的密

19、度为1.33 g/ml； 氯化铯25的密度为1.91 g/ml。 2、对样品的生物活性不能有影响。 3、不能影响所使用的测量技术。 4、注意能否进行高温消毒，对转头是否有影响。,密度梯度的制备 1、间隔2或5，常温下放一晚上成近线性梯度。 2、使用中间密度的溶液冻融2次。 3、密度梯度形成器。 4、阿贝折射仪检验梯度。,手动式梯度混合室示意图,1、虹吸法：用一根细管插到离心管的底部，将溶液吸出，用试管分部接收，然后进行分析。 2、顶替法：把一种很稠的介质，如60-70的蔗糖溶液慢慢注入离心管底部，将离心管中的溶液顶替出来。 3、穿刺法：将离心管固定在支架上，在离心管底部贴一块胶布，防止穿刺后液

20、体泄漏。用针头仔细穿过塑料离心管的底部，此时液体顺针头缓缓地逐滴流出，可用试管按体积分部接收，然后进行分析。 4、冷冻切段法：将离心好地试管进行冷冻，再切成段，将不同的区带分开。,梯度的取出,收集密度梯度离心分离后各级分的方法,注意事项 1、温度：在相同温度下制作梯度液，所有与样品接触的东西的温度都要与样品离心时接近。 2、操作中防止污染。,离心技术中需要注意的几个问题 1、不要过速运转；尽量减小在最大允许离心速度下离心的时间。 2、平衡组装并运转转头；转头要轻拿轻放；每次用后清洗干净。 3、高速或超速离心机的转头使用前要预冷。,例1： 冠状病毒的分离纯化,冠状病毒是引起感冒的主要病原，只感染

21、脊椎动物，引起人与动物的呼吸道、消化道与神经系统病患。 冠状病毒几何尺寸为100-200 nm，沉降系数700 S-800S，在蔗糖液中的密度约为1.15-1.19。,1、取感染组织制成匀浆，普通低温离心机3,000 rpm离心20 分钟，弃去沉淀。 2、取上清液少许滴在装有火棉胶膜的铜网上，滤纸吸干后吹干，浸在2醋酸铀中染色，然后在透射电镜中初步观测，确认是否有病毒存在。 3、上清液作等密度离心分离，日立P40ST或其它品牌类似甩平转头，613 ml，12 ml 10-50蔗糖连续线性梯度，蔗糖梯度液表面铺上清液至距离管口3 mm，33,000 rpm离心1小时，病毒沉降在36蔗糖梯度附近。

22、,例2： 血清脂蛋白的离心分离,极低密度脂蛋白（very low density lipoprotein, VLDL）,低密度脂蛋白（low density lipoprotein, LDL）,高密度脂蛋白（high density lipoprotein, HDL）,中密度脂蛋白（intermediate density lipoprotein, LDL）,（1.063 g/cm31.21 g/cm3）,（1.006 g/cm3）,（1.006 g/cm3 1.016 g/cm3）,（1.016 g/cm3 1.063 g/cm3）,溶液的配置 干燥的NaBr晶体，在210恒温箱中过夜。分别配置下列不同密度的NaBr液体： 1.006 g/ml （9 g/L） 1.019 g/ml （27 g/L） 1.063 g/ml （95 g/L） 1.210 g/ml （283.4 g/L） 1.386 g/ml （524.8 g/L） 所有溶液均含0.05 EDTA（pH7.0），溶液经过滤后储存在暗褐色瓶中，4保存。,方法一,将已稀释的血清样品1 ml置于14 ml 离心管底部，然后往上依