《科内讲课要点》PPT课件.ppt

1、2020/8/27,1,基因扩增及其相关检测技术应用,2020/8/27,2,一、基因体外扩增,是指体外无细胞的分子克隆或酶促扩增。 以 DNA 或RNA 分子为模板，在引物诱导下，根据碱基配对原则， 利用反应体系中的 dNTPs 为原料，酶促合成新的DNA序列，使基因拷贝数得以增多的技术。,2020/8/27,3,基因体外扩增方法,聚合酶链式反应（PCR） 以PCR技术为基础的相关技术（逆转录PCR、巢式PCR、多重PCR、定量PCR、原位PCR、单细胞PCR等） 实时PCR PCR产物分析 ,2020/8/27,4,（一）PCR技术,2020/8/27,5,PCR（polymerase c

2、hain reaction）,聚合酶链式反应： 指利用模板 DNA、RNA 为指导，在引物引导下， DNA 聚合酶促化合成、扩增 DNA 序列的技术。又称体外分子克隆。,2020/8/27,6,PCR反应原理,PCR 技术的原理类似于 DNA 天然复制过程，其特异性依赖于靶细胞序列两端互补的寡核苷酸引物。 PCR有变性退火延伸三个基本反应步骤构成。,2020/8/27,7,PCR反应原理,(1),(2),(3),(1),模板DNA变性,模板与引物的退火（复性）,引物的延伸,模板DNA变性,TaqDNA dNTPs,2020/8/27,8,PCR反应体系的组成:,引物 酶 dNTP 模板 Mg2

3、+ 探针,2020/8/27,9,引物：,引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决引物与模板DNA互补的程度。 PCR引物的要求： 片段特异、长度、 CG%、浓度等。,2020/8/27,10,酶及其浓度：,两种Taq DNA聚合酶（Thermus Aquaticus） 从栖热水生杆菌中提纯的天然酶 大肠菌合成的基因工程酶。 浓度：浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少,2020/8/27,11,dNTPs：(A、C、G、T),dNTPs四种脱氧核苷三磷酸是DNA合成的基本原料 dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系。 在PCR反应中，dNTP应为50200

4、 mol/L，浓度过低又会降低PCR产物的产量太少，出现假阴性。,2020/8/27,12,模板核酸：,模板核酸提取质量是PCR成败与否的关键环节之一 提取效率 扩增效率 传统的DNA纯化方法： 热裂解法 蛋白酶消化法,2020/8/27,13,RNA模板：,RNA模板提取一般采用： 异硫氰酸胍-氯仿-酚抽提法 蛋白酶K法-氯仿-酚抽提法 要防止RNase降解RNA： 干烤或DEPC（焦碳酸二乙酯）处理,2020/8/27,14,Mg2+浓度：,Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的，其浓度高低直接影响着酶的活性与忠实性 Mg2+浓度为1.52.0 mmol/L为宜，Mg 2+对PCR扩增的

5、特异性和产量有显著的影响 Mg 2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少,2020/8/27,15,PCR反应条件的选择,缓冲液: pH 8.38.8 ，Tris-HCl缓冲液 1050mMol/L PCR反应温度与时间 循环次数,2020/8/27,16,三温度法： 90 95（94 10S）变性 30s 40 60 （55 30S）退火，30s1min 70 75 （72 40S ）延伸，12min 二温度点法 94变性（ 94 5S ） 60左右退火与延伸（60 40S）,温度与时间,2020/8/27,17,循环次数：,循

6、环次数决定PCR扩增量。在其他参数都优化的条件下，最适循环次数取决于靶序列的初始浓度。初始浓度较低时，要增加循环次数。酶的活性不好或量不足时，也要增加循环次数，已达到有效扩增量。 一般的循环次数选在3040次之间。 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。,2020/8/27,18,PCR产物检测,终点检测法（定性） 凝胶电泳分析法 点杂交法 微孔板夹心杂交法 PCR-ELISA 实时检测法（定量）,2020/8/27,19,PCR扩增产物的电泳分析,PCR电泳法是科研不可缺少的手段 琼脂糖电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳,2020/8/27,20,琼脂糖凝胶电泳,1. 凝胶与电泳缓冲液配制 2.核

7、酸电泳的指示剂与染色剂 溴酚兰 溴化乙锭染色法 3. 电泳： 4. 结果观察： 紫外仪上观察电泳带及其位置，并与核酸分子量标准比较被扩增产物的大小,2020/8/27,21,琼脂糖凝胶电泳条带,2020/8/27,22,聚丙烯酰胺凝胶电泳,聚丙烯酰胺凝胶的制备 电泳：电压为1-8V/cm 观察： 浸入含0.5ug/ml的溴化乙锭溶液中，1530min后取出水洗紫外仪下观察结果,2020/8/27,23,PCR电泳法检测的局限性,产物非杂交检测，特异性差 开放操作，扩增产物（百万倍）气溶胶的污染问题突出 非定量检测，无法观察疗效 肉眼判读，人为误差（扫描） 溴化乙锭的致癌作用,（二）实时荧光定量

8、PCR,2020/8/27,25,实时荧光定量PCR原理,实时荧光定量PCR技术: 在PCR反应体系中加入荧光探针基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。,2020/8/27,26,荧光域值（threshold）的设定,PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，荧光域值的缺省设置是6-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍，即： threshold = 10 SDcycle 6-15,2020/8/27,27,Ct 值的定义,在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念 Ct值。 C代表Cycle，循环次数。t代表threshold，

9、阈或界限之意。 Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。,2020/8/27,28,2020/8/27,29,Ct值与起始模板的关系,每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。 利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。,2020/8/27,30,因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。,2020/8/27,31,2020/8/27,32,TaqMan荧光探针,PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端

10、分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。,2020/8/27,33,探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收。 PCR扩增时，Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解，荧光基团和淬灭荧光基团分离。 实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。,2020/8/27,35,注：探针完整时，报告基团发射的荧光信 号被淬灭基团吸收,2020/8/27,36,PCR扩增时， Taq酶的53外切酶活性将探针酶切降解,2020/8/27,37,荧光基团和淬灭荧光基团分离,2020/8/27,38,每扩增一条DNA链， 就有一个荧光分子形成，,2020/8/27,39,PCR.swf原理flash

11、,2020/8/27,40,实时荧光定量PCR的特点,1.特异性强 FQ-PCR具有引物和探针的双重特异性，故与传统的PCR相比，特异性大为提高。 2.灵敏度高 灵敏度可达到102拷贝，线性范围可到达102 108拷贝。一般来讲临床标本中病原体的数目为0-1010/拷贝。,2020/8/27,41,3.重复性 FQ-FCR结果相当稳定，同一标本的CT值相同，但其产物的荧光量却相差甚大。因为域值设置在指数扩增期，在此阶段，各反应组分浓度相对稳定，没有副作用，CT与荧光信号的对数呈线性关系。,荧光定量PCR的特点,2020/8/27,42,4.污染率小 全封闭的体系，有效地减小污染的机率。 5.方

12、便、快速、准确 FQ-PCR周期短，自动化程度高，有非常严密的数学理论支持。,荧光定量PCR的特点,二、临 床 诊 断 应 用,治疗前 选择治疗的人群 选择治疗的时机 选择治疗的方案 治疗中 评价疗效、更换治疗方案、（治疗终点的确定 ? ) 治疗后 疗效持久性评估、监测复发,临床病原体,HBV HCV HIV 结核病（TB） 巨细胞病毒（CMV） 单纯疱疹病毒（HSV）,性传播疾病,1.沙眼衣原体（CT） 2.淋球菌（NG） 3.人乳头瘤病毒（HPV） 4.解脲支原体（UU） 性病PCR检测意义：常规的检测方法特异性不强，误诊率较高，而FQ-PCR具有快速、特异性强、敏感度高、无交叉反应等优点

13、 ，有效地避免了假阴性假阳性的出现，结果真实可靠，具有指导意义。,血液标本抗凝剂的选择,检测RNA病毒，由于RNA极易降解，标本的制备和保存方式往往可以影响测定结果，应使用EDTA抗凝，严禁使用肝素。 检测DNA病毒一般用EDTA-K2/Na2或枸橼酸钠抗凝，不可使用肝素。标本为血清时，应及时分离出血清，提取病毒DNA进行检测。 应避免溶血，脂类可干扰PCR反应 。,采血管,2020/8/27,47,2020/8/27,48,乙肝病毒（HBV）荧光定量 检测,FQ - PCR 可以对乙肝病毒DNA 进行准确定量，在乙肝的预防、诊断、治疗上都具有显著的优越性。,HBV DNA监测在长征之路中的作

14、用,慢性乙型肝炎核苷类似物应用路线图的中国临床应用,开始核苷类似物治疗,24周HBV DNA: 更合理的疗效预测点,12周HBV DNA: 评估治疗应答 HBV-DNA较基线下降,高度应答 2.0E2 IU/mL,中度应答 2.0E+2 IU/mL 2.0E+3IU/mL,低度应答 2000IU/mL),建议加用其他有效药物,继续治疗 每3月监测一次,继续治疗 每3月监测一次,52周时,如果200IU/mL 继续单药治疗,52周时,如200IU/mL 建议加用其他有效药物,52周时,如果(200IU/mL 继续单药治疗,52周时,如果103 copies/mL(200IU/mL) 建议加用其他

15、有效药物,乙肝病毒（HBV）荧光定量 检测,丙肝病毒（HCV）荧光定量 检测,慢性丙型肝炎的RGT治疗策略,53,内标法在抗病毒治疗中的意义,评价疗效更准确 决定治疗方案(药物的剂量？单药还是联合？疗程？） 改变策略（停药？再联合？) 治疗终点的选择 预测复发,超敏感（Hypersensitivity） HBV最低检测限10-15 IU/ml 宽线性范围（ wider dynamic range ） 涵盖101109 IU/ml 高特异性（ High specificity） 可重复性好（ Repeatability） （操作简单，或可自动化）,国际乙肝治疗指南对HBV DNA定量PCR要求,治疗时间（周）,pEVR误判为cEVR可能导致所谓的“复发率”升高,0周,12周,24周,48周 (EOT),HCV RNA (IU/mL),误判为cEVR,HCV RNA下降值2 log10 (IU/mL),72周 (SVR),终止治疗,复发,由于pEVR患者被误判为cEVR，未延长疗程，导致出现所谓的“复发”,国