杂交水稻的扩增.ppt

1、杂交水稻种子纯度的鉴定,RAPD 扩增,传统的种子 纯度鉴定主要有田间鉴定法和实验室鉴定法。实验室鉴定种子纯度主要依据种子的物理、化学及生理特性等。但随着生物化学及分子生物学技术的迅速发展，种子纯 度鉴定技术产生了质的飞跃，现代生物化学和分子生物学技术被成功地引入到种子纯度的鉴定中，如分子标记等。,分子标记是指以生物大分子的多态性为基础 的遗传标记 。 广义的分子标记包括同工酶标记和DNA标记 狭义的分子标记仅指DNA标记 DNA标记主要有：,RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism 即限制性片断长度多态性) 它是由于核酸序列不同而造成的DN

2、A限制性 片断之间产生等位基因差异的结果。 2. RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)。3. AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片段的长度多态性)。4.SAP(Specific Amplified Polymorphism, 特异性扩增长度多态性)。,RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA，随机扩增多态性DNA)是1990年由美国科学家J.G.K.Williams和加利福尼亚生物研究所J.Welsh领导的两个小组几乎同时发展 起来的一

3、种DNA指纹技术，它是以DNA为模板，以一个随机的寡聚核苷酸序列(10个碱基)为引物，通过PCR扩增，产生分子量大小不连续的DNA片段， 通过琼脂糖凝胶电泳来检测DNA多态性,一般讲,通过PCR扩增产生的不连续的几个DNA产物,往往是由于不同的遗传位点而产生,多态性的产生是由于突变或重排而造成的,这些变化可以发生在引物结合位点上,也可以位于引物结合序列之间。,RAPD用用于杂交水稻种子纯度鉴定的工作原理,DNA多态性是指DNA碱基顺序的差异性。这种差异性不仅存在于不同的植物之间，也存在于同一种植物的不同个体之间。,它们的基因组DNA 限制性内切酶位点的种类和数目不同，用各自DNA为模板，以一个

4、随机的寡聚核苷酸序列(10个碱基)为引物，通过PCR扩增，产生分子量大小不连续的 DNA片段，通过琼脂糖凝胶电泳分离和溴化乙锭染色，在紫外检测仪下观察，即可直接看到这种差异,RAPD技术操作过程：,一、 材料 杂交水稻的DNA(50ng/ul)。 二、设备 PCR仪，PCR管或硅化的0.5ml eppendorf管，电泳装置。,三、试剂 1、随机引物(10mer) (5umol/L)：购买成品。 2、Taq酶：购买成品。 3、10 xPCR 缓冲液。 4、MgCl2 ：25mmol/L。 5、dNTP：每种2.5mmol/L,四、操作步骤： 1. 在25ul反应体系中,加入 模板DNA 1ul

5、 (50ng) 随机引物 1ul (约5pmol) 10 xPCR Buffer 2.5ul MgCl2 2ul dNTP 2ul Taq酶 1单位（U） 加ddH2O 至 25ul 混匀稍离心, 加一滴矿物油。,2. 在加热至90以上的PCR仪中预变性94 2分钟, 然后循环: 94 1分钟， 36 1分钟， 72 1分钟，共35轮循环。 3. 循环结束后, 72 10分钟，4保存。 4. 取PCR产物15ul加3ul上样缓冲液(6x)于2% 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100V（电压低带型整齐， 分辨率高）。 5. 电泳结束，观察、拍照。,PCR(聚合酶链式反应)，即通过引物延伸核酸的某个

6、区域而进行的重复双向DNA合成。PCR循环过程有三种不同的事件发生： 1. 模板变性（92-96）； 2. 引物退火（37-65）； 3. 热稳定DNA聚合酶进行DNA合成-延伸（72）。,变性、退火、延伸的循环过程-PCR扩增。在第二个循环中，新链作为模板参与反应，每完成一个循环将使目的DNA扩增一倍，25-35个循环后，目的DNA将达到106倍。琼脂糖电泳、EB染色即可得到DNA指纹图谱。,注意事项 1、电泳时一般RAPD带有5-15条, 大小0.1-2.0kb。 2、 特异性的DNA带可以克隆作为一个新的分子标记应用。,RAPD技术的优点,不使用同位素，减少了对工作人员健康的危害； 可以在物种没有任何分子生物学研究的情况下分析其DNA多态性； 对模板DNA的纯度要求不高；,技术简单，无需克隆DNA探针，无需进行分子杂交； 灵敏度高，可提供丰富的多态性； RAPD引物没有严格的种属界限，同一套引物可以应用于任何一种生物的研究，因而具有广泛性、通用性。,但是，RAPD技术较易受到各种因素的影响。无论是模板的质量和浓度，短的引物序列，PCR的循环次数，基因组DNA的复杂性，技术设备等，都有可能是RAPD技术重复性差的直接原因。,目前，多从以下几个方