显微镜的使用.ppt

1、动物染色体制备 小鼠骨髓染色体,HAT培养基,主要组分 H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤 A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径 T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通过替代途径合成DNA 选择作用 淋巴细胞：不能生长，57天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断 骨髓瘤细胞：不能生长，57天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻,目的要求,掌握动物骨髓细胞染色体制备的基本过程及原理。 掌握小鼠骨髓细胞染色体制备步骤及试剂的作用。 观察小鼠染色体的形态特征及数目,实验原理,染色体只有在分裂期的细胞，特别是中期细胞中表现出

2、典型形态便于观察和计数。 用秋水仙素处理骨髓细胞后，使分裂细胞阻断在有丝分裂中期，再经低渗处理、固定、滴片、染色等步骤，得到染色体标本。 最常用的是骨髓细胞、血淋巴细胞和组织培养的细胞。,方法与步骤,注射秋水仙素 （Cochicine） 实验前34小时，向腹腔内注射秋水仙素。注射浓度随动物种类不同而异。秋水仙素的主要作用是抑制纺锤体的形成，使有丝分裂停于中期，增加中期分裂相的比例。,处死小鼠 ：颈椎脱臼法,1、剪取小鼠的后肢，注意不要将股骨两端关节剪断，否则容易造成骨髓细胞的流失。2、将股骨上皮肤、肌肉用剪刀、纱布清除干净，然后将股骨两端的关节剪去，使股骨两端相通。,取股骨：,用小针筒吸取 0

3、.075mol/L KCl低渗液(5ml)，在培养皿中反复冲洗骨髓腔，使骨髓细胞全部洗脱出来。,收集细胞：,实验步骤,5ml反复冲洗,加固定液5滴,终止低渗前12min,秋水仙素,颈椎脱臼,小白鼠,处理,实验前34h,处死、取股骨,KCl低渗液,收集骨髓细胞,37静置,30min,低渗,混匀、预固定,2000转分,5min,离心、弃上清,加固定液5ml、混匀,10min,固定,2000转分,5min,离心、弃上清,8-10滴固定液,细胞悬液,吹打混匀,预冷的玻片,低渗：0.075mol/L KCl 固定：甲醇:冰醋酸 3:1 滴片：20-30cm的高度 (预冷洁净的载玻片) 染色：Giemsa

4、染液 7min 镜检：“U”形染色体2n=40,结果观察,结果观察,结果观察,结果显示,小鼠染色体的特点：呈“U”型，全部为端着丝粒染色体； 40条（19对常+1对性）,小鼠染色体核型图：,注意事项：,1. 把握好秋水仙素的浓度和处理时间。 2. 控制好离心的速度。 3. 低渗处理是实验成败的关键，其目的是使细胞体积胀大，染色体松散。低渗处理时间过长，会造成细胞破裂，染色体丢失。低渗处理时间不足，细胞内染色体易聚集在一起，观察时无法准确分辨与计数。 4. 固定液要现用现配。 5. 用吸管吹散细胞时用力必须尽量轻柔。 6. 载玻片要洁净、预冻；滴片要有一定高度。,人染色体制备,镜下所见染色体,非

5、显带染色体,G-带染色体,染色体G显带制作技术,原理：G显带技术是指经胰蛋白酶处理后用Giemsa染色的方法。也是目前最基本最常用的染色体分析技术，它不仅能对染色体数目，而且能对染色体结构畸变进行分析。,为什么经胰蛋白酶处理后染色体上会出现深浅不同的带纹呢？这与染色体的化学成份有关。 染色体经蛋白水解酶类物质处理后，蛋白质部份被水解，使DNA中碱基暴露。由于DNA中碱基组合的比例不同，对染料结合程度不同，形成深浅不同的带纹。,实 验 操 作,1.将染色体标本放入60-70度烘箱中烤2-3小时，然后放入37度恒温箱中备用。 2.把配制成0.042%胰蛋白酶液置室温预温。 3.取一张玻片浸入已预温的胰酶溶液中，处理大约20-25秒左右。 4.缓冲液冲洗。 5.1:10 Giemsa液染色8分。