生物技术在园艺植物育种中的应用.ppt

1、第十一章生物技术在园艺植物育种中的应用,生物技术(Biotechnology):以生命科学为基础，利用生物体的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，以及与工程原理相结合进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性技术体系。 生物技术是在分子生物学和细胞生物学基础上结合现代工程学的方法和原理而发展起来的一门综合性科学技术。,第一节 组织与器官培养,第二节 花药与花粉培养,第三节 原生质体培养 第四节 体细胞杂交,第五节 植物细胞突变体的离体筛选,第六节 基因工程与育种,第七节 分子标记与育种,主要内容：,植物组织培养（Plant Tissue Culture）,将植物离体器官、组织

2、或细胞等外植体，在适宜的人工培养基和无菌条件下，给予光照、温度等环境条件并培养，使其生长、增殖、发育形成小植株的方法。 狭义的组织培养仅指愈伤组织培养，广义的组织培养指各种类型的植物无菌培养技术。组织培养概念多指广义上的组织培养技术，包括胚胎培养、器官培养、组织培养(愈伤组织培养)、细胞培养、原生质体培养等。,植物特殊 倍性创造,植物 组织培养,培育植物 新品种,种苗脱毒与 快速繁殖,体细胞杂交,次生产物 生产,基础研究,第一节 组织与器官培养,组织与器官培养的类别,组织与器官培养的应用,茎尖和分生组织培养 胚培养 胚珠和子房培养 胚乳培养 离体叶的培养,组织与器官培养(tissue and

3、organ culture):,相关专业术语,细胞全能性(totipotency): 一个细胞所具有的产生完整生物个体的固有能力。 外植体(explant):用于培养的离体材料。 愈伤组织(callus):在培养过程中，从植物各种器官、组织的外植体增殖而形成的一种无特定结构和功能的细胞团。 胚状体(embryoid):由外植体或愈伤组织产生的,与正常受精发育方式类似的胚胎结构。 继代培养(subculture)：对外植体增殖的培养物(包括细胞、组织或其切段)通过更换新鲜培养基及不断切割或分离，进行连续多代培养。,组织和器官培养全过程可分四个阶段:,无菌培养物的建立,营养繁殖体的增殖,生根,植株

4、移栽,各个阶段在培养基,生长调节剂的配比和浓度, 培养方式和环境上都不同的要求.,组织和器官培养在育种中的作用,加快园艺植物新品种和良种繁殖速度 培养无病毒苗木 诱发和离体筛选突变体 进行种质资源长期保存和远距离运输 获得倍性不同的植株 克服种子发育和萌发中的障碍 克服远源杂交困难 提供育种中间材料,第二节花药与花粉培养,花药培养,花粉培养,花药培养：其外植体为植物雄性生殖器官的一部分，就培养方法和技术来讲，属于器官培养的范畴。 花粉培养：将处于一定发育阶段的花粉从花药中分离，再加以离体培养。有时花粉培养也称为小孢子培养(microspore culture)。从培养方法和技术方面来讲，它属于

5、细胞培养的范畴。,花药培养的基本程序,外植体选择外植体(花蕾)预处理外植体消毒剥取花药接种诱导培养分化培养,在离体培养条件下要使花药中的花粉改变其正常发育方向而形成单倍体植株，需要各种因素共同调节和控制。,外因：培养基的成分，外源激素的种类，糖的浓度,内因：主要决定于花药中花粉发育时期,培养基,花药培养常用的基本培养基： MS（Murashigc & Skoog，1962）； Nitsch (Nitsch，1969)； N6 (朱至清，1974)； B5 (Gamborg etal.，1976)。 附加成分：蔗糖, 激素。,花药培养常用的激素 细胞分裂素类： BA 6-benzyladenin

6、 KT kinetin Zeatin 生长素类： NAA naphthalene acetic acid IAA indole-3-acetic acid 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid,蔗糖:蔗糖在花药诱导培养阶段的功能主要是：提供C源；维持适宜的渗透压；抑制花药壁的分裂而促进花粉细胞分裂。,番茄花药培养对蔗糖浓度的诱导反应 蔗糖浓度（） 2 3 4 6 10 13 17 诱导频率（） 5 10 12 18 25 45 8,花粉发育时期 四分体 小孢子 单核花粉双核花粉 最适期,花粉及小孢子培养,1取材时期的确定 四分体单核早期单核晚期双核早期双核晚

7、期三核期,小孢子,花粉粒,花药培养与小孢子培养的目的一样，为获得单倍体。单倍体(haploid):指具有配子体染色体数的孢子体 (植物个体)。 diploid 植物，其haploid即为monoploid 玉米 2n = 2x = 20 n = x = 10 柑橘 2n = 2x = 18 n = x = 9 tetraploid植物，其haploid为dihaploid 马铃薯 2n = 4x = 48 n = 2x = 24 hexaploid植物，其haploid为triploid 普通小麦 2n = 6x = 42 n = 3x = 21 octoploid植物，其haploid为te

8、traploid 草 莓 2n = 8x = 56 n = 4x = 28,单倍体在育种中有特殊的地位，其作用表现在,加倍后可迅速获得纯合型材料，缩短育种年限。 获得育种中间材料。 与诱变育种相结合可以提高诱变频率。 与细胞融合相结合，使这一育种途径更具有实际应用意义，无籽三倍体。 作为遗传工程受体更为有效。 用于基础遗传研究的各个领域。 获得超雄植株（YY )。 可获得异源体附加系、代换系和易位系。,第三节 原生质体培养,原生质体培养和体细胞杂交的步骤 原生质体培养（Protoplast culture） 体细胞杂交（Somatic hybridization） 原生质体融合（Protopl

9、ast fusion）,一.原生质体的概念,原生质体(protoplast)：指除去细胞壁的细胞或是说一个被质膜所包围的裸露细胞。 亚原生质体(subprotoplast)：在原生质体分离过程中，有时会引起细胞内含物的断裂而形成一些较小的原生质体就叫做亚原生质体。它可以具有细胞核或没有细胞核。 核质体(nuclearplast)：由原生质膜和薄层细胞质包围细胞核形成的小原生质体。也称为微小原生质体(miniprotoplast)。 胞质体（cytoplast）：不含细胞核而仅含有部分细胞质的原生质体。,二.原生质体的分离,基础材料准备,预处理与酶解,原生质体活力测定,原生质体收集与纯化,1.分

10、离原生质体材料的准备,无菌试管苗叶片 上胚轴和子叶 培养细胞,2. 预处理及酶解,酶,酶解,渗透压 调节剂,材料预处理 在游离原生质体前对供体材料进行预处理及预培养，可以提高某些材料原生质体的活力和分裂频率。 用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。不同植物及材料类型预处理方法不同。 例如龙胆试管苗的叶片只有用4低温处理，甘蔗植株必须先在黑暗条件下培养12h后分离的原生质体才能分裂。,原生质体分离常用的商品酶,酶溶剂及其渗透压 溶剂：原生质体培养基或特殊配制。 渗透压调节剂：葡萄糖、甘露醇、山梨醇等。,酶处理,l,3、原生质体的分离纯化,原生质体的收集和纯

11、化,飘浮法：常用的飘浮剂有蔗糖、Percoll、Ficoll。 沉淀法：常用甘露醇作为渗透压调节剂，先将酶液洗出干净，再用Percoll飘浮一次。,4.原生质体活力测定,目测法：在显微镜下观察，根据细胞形态、流动性确定原生质体活力。 FDA法：FDA（二乙酸荧光素）是一种非极性物质，能自由地穿越细胞质膜，在活细胞内，FDA被酯酶裂解即发荧光（荧光素），由于荧光素不能自由通过质膜，因而可以在荧光显微镜下通过具荧光的细胞的观察确定细胞活性。 伊凡蓝法：伊凡蓝不能穿过质膜，只有质膜受到严重损坏，细胞才能被染色，因而可以通过细胞被染色与否确定活性。,FDA荧光染色法( 双醋酸荧光素) 在荧光显微镜下，

12、有活力的原生质发荧光，无活力的不发荧光。,生活力测定：,影响原生质体活力的因素,分离材料的生理状态 酶解条件 酶质量、浓度、酶解温度、酶解时间、酶溶液的渗透压 分离条件 离心次数、离心速度、纯化方法、分离持续时间 环境条件 操作环境的温度、分离用具的影响,三、原生质体培养,原生质体培养基,原生质体培养方法,1.原生质体培养基,无机盐 大量元素浓度； NO3和NH4+的比例； Ca2+浓度 有机成分 维生素、氨基酸、糖及糖醇等，酵母提取物、水解酪蛋白。,2、原生质体培养方法,液体浅层培养 固体平板培养 固-液体双层培养 琼脂糖珠培养,原生质体培养,柑桔融合,实例,第四节 体细胞杂交,定义：将两个

13、不同亲本的原生质体，经人工诱导融合并培养再生成株的过程，统称为体细胞杂交（A + B） 几种不同的表述： 体细胞杂交：Somatic hybridization 细胞融合：Cell fusion 原生质体融合：Protoplast fusion 无性杂交：asexual hybridization 超性杂交：Parasexual hybridization 超性融合：Parasexual fusion 细胞工程：Cell engineering,植物细胞杂交的几个重要进展 1960年，Kocking用酶法制备高等植物原生质体首次获得成功； 1971年，Takebe首次从离体烟草原生质体培养中获

14、得再生完整植株； 1972年，Carlson首次获得粉蓝烟草和郎氏烟草的细胞杂种，这是第一个植物细胞杂种； 1974年，Kao将聚乙二醇诱导融合法应用于植物细胞融合并建立了相应的融合技术； 1978年，Melchers获得第1个属间细胞杂种（番茄马铃薯）； 1981年，Zimmerman发明电融合仪，并首次提出电融合概念； 1987年，Schweiger建立单对原生质体电融合技术程序。,体细胞杂交与有性杂交的异同,+,体细胞杂交,有性杂交,原生质体融合的有关名词-I,对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质均为100%） 非对称杂种（双亲给杂种贡献的遗传物质不等（相对值） 胞质杂种（cytoplas

15、mic hybrid, Cybrid）：细胞质重组，细胞核未重组 对称融合（symmetric fusion） 也称标准融合（Standard fusion） 非对称融合（asymmetric fusion）：融合前对一方进行处理，使其染色体丢失一部分,原生质体融合的有关名词-II,供-受体融合：Donor-recipient fusion 体配融合（gameto-somatic fusion）（性细胞与体细胞融合） 亚原生质体-原生质体融合： Subprotoplast-protoplast fusion 小原生质体：Miniprotoplast 微原生质体：Microprotoplast

16、胞质体：Cytoplast 胞质体-原生质体融合: Cytoplast-protoplast fusion,原生质体融合的方式,化学方法：聚乙二醇法 Polyethylene glycol （PEG），与高pH高Ca结合使用 物理方法：电融合法 Electrofusion, Electrically induced fusion,理论上，任何细胞都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源，这对种质资源的开发和利用具有深远的意义。 融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。 体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程

17、中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。,体细胞杂交的程序及方法,原生质体融合,杂种细胞筛选,方法：PEG，电融合， NaNO3,营养互补选择法， 遗传互补选择法， 机械选择法，,形态学方法 细胞学方法 同工酶方法 分子标记法,体细胞杂种植株的鉴定,亲本A,亲本B,原生质体聚合,融合处理,分离的原生质体,原生质体融合,融合体移植,杂种融合体筛选,杂种融合体移栽 至不同的培养基,体细胞杂交筛选,原生质体培养和体细胞杂交的应用,获得新品种； 创造新种质； 转移有利性状和克服远源杂交的障碍； 作为基因工程的良好受体及进行突变体筛选的优良原始材料。,第五节 植物细胞突变体的

18、离体筛选,在离体培养条件下，诱发突变的突变型和自发突变没有本质上的差别。一般都在三个水平上发生： 基因组突变：染色体数目的改变或细胞质基因组的增减； 染色体突变：染色体较大范围的结构变化，涉及多个基因； 基因突变：指范围在一个基因以内分子结构的 改变。按DNA改变方式有碱基置换突变，移码突变，缺失突变和插入突变。 体细胞无性系变异：Somaclonal variation,一、突变体的产生,二、突变细胞的筛选方法,直接选择法 正选择/负选择,间接选择法,正选择,用一种含有特定物质的选择培养基，在此培养基上只有突变细胞能够生长，非突变细胞不能生长，从而直接筛选出突变体。如抗除草剂、抗盐碱突变体的筛选，均可直接在培养基中加入一定浓度的除草剂或增加渗透压的物质。目前采用这一途径，已从多种植物中筛选出可利用的体细胞变异体。 贾敬芬等以小麦幼胚愈伤组织为材料，在含有1.4 NaCl的N6培养基上直接筛选出小麦耐盐系。分析显示，耐盐系游离氨基酸含量是供体亲本的4.1倍。 郑企成等也曾将小麦“京花1号”花药经射线处理后，再经0.5 NaCl培养基直接筛选获得耐盐