AC_XP.ppt

1、第 五 章 亲 和 层 析 （AC） Affinity Chromatography,第一节 基 本 原 理,根据生物分子间亲和吸附和解吸的原理建立起来的色谱法称为亲和色谱法。 一、生物大分子的专业结合作用 抗原和抗体 酶和底物及辅酶 酶和抑制剂 激素和受体 外源凝集素和糖蛋白 RNA和其互补的DNA等,二、亲和层析的特点,分离迅速、操作简便。 可一步纯化 专一性强 缺点是使用局限性大,Sample: 600 ml mouse monoclonal IgGa Gel: rProtein A Sepharose Fast Flow Elution:20 mM Sodium Citrate, pH

2、 4.0 Result: 83 mg Mab, recovery 95%,Starting material,Eluate,94 43 30,SDS-PAGE reduced,Purifying monoclonal antibodies,三、亲和层析的必要条件,合适的配体（配基、ligand) 合适的载体（Matrix) 合适的吸附和洗脱条件,第二节 配 基,亲和色谱中两个进行专一结合的分子互称为配基。 作为配体的条件 亲和力大 具有解离平衡 与载体偶联不失活,Binding equilibria,Binding,Elution,L : ligand T: target,Binding eq

3、uilibria,At equilibrium,KD is the equilibrium dissociation constant, L is the concentration of free ligand T is the concentration of free target LT is the concentration of the ligand/target complex,Binding equilibria,L + T,LT KD 10-6 - 10-4 M,Binding,L + T,LT KD 10-1 - 10-2 M,Elution,We can change K

4、D by changing pH, temperature, salt concentration etc.,Elution by changing KDExpected results,Target elutes as a sharp peak,KD low (10-6 M),KD high (10-1 M),KD changes when pH, ionic strength etc is changed,Best,配体的选择,酶：底物、抑制剂、辅酶、效应剂 抗体：抗原、病毒、细胞 外源凝集素：多糖、糖蛋白、细胞表面受体 核酸：互补碱基序列、组蛋白、核酸聚合酶 、结合蛋白 激素及维生素：受

5、体、载体蛋白 细胞：细胞表面特异蛋白、外源凝集素,三、配体的浓度,一般使用较高的固定化配体浓度 当配体亲和力高，且本身带电则固定化配体浓度须降低,第 三 节 载 体,作为载体的条件 1.亲水 2.惰性 3.具有活化基团 4.大网孔 5.机械性能好,二、载体的选择,1.琼脂糖凝胶： 亲水性强，理化性质稳定 （商品名：Sepharose） 2.聚丙烯酰胺凝胶： 理化性质稳定，耐有机溶剂及去污剂， 抗微生物能力强， 特别适应用配基与提取物亲和力比较弱的物质。 3.葡聚糖凝胶： 有良好的化学及物理性质，孔经小。 4.纤维素： 非特异吸附严重，廉价，易得。 5.多孔玻璃 ：物理性能好，有非特异性吸附。,

6、Scanning electron micrograph of an agarose gel,Magnification x 50,000,Ref:Anders S. Medin, PhD Thesis, Uppsala University 1995,第四节 手 臂,手臂的作用 消除配体的空间位阻 手臂的长度和特点 H2N(CH2)nNH2 n = 2,4,6,8 具有疏水性,第五节 亲和层析的吸附和解吸,吸附的条件 pH、离子强度、温度、时间 吸附的方法 动态法、静态法 非专业性洗脱 通过改变pH，离子强度，温度进行洗脱 阶段洗脱，梯度洗脱,专业性洗脱 采用水溶性配体洗脱 脉冲洗提 采用酶

7、促反应的多元专一性洗脱 两元专一性 三元专一性 化学裂解 连二亚硫酸硫酸钠还原、高氯酸、盐酸胍 三氯醋酸、尿素,专业性洗脱,采用水溶性配体洗脱 以与固定配体相同的高浓度游离配体作为洗脱剂进行洗脱。（20Km, 20Ki) E + I EI 脉冲洗提 只以一段含游离配体的洗脱剂进行洗脱。 （节省方式）,3.采用酶促反应的多元专一性洗脱,三元复合物 两元专一性 负洗脱 E + A EA + B EAB A AE A -A洗脱 A 三元复合物 三元专一性 正洗脱 E + A EA + B EAB + A +C洗脱 C AE A EAC A C EAC,E = 乳糖合成酶A蛋白 B = - 乳清蛋白

8、E + A EA + B EAB A = N 乙酰 D 氨基葡萄糖,负洗脱,两元专一性,三元专一性的 亲和层析洗脱设计,正洗脱 A = NAD+ B = AMP C = Py E = LDH,五、化学裂解,连二亚硫酸硫酸钠还原、高氯酸、盐酸胍 三氯醋酸、尿素,第六节 亲和层析的实验技术,载体的活化亟与配体的偶联,1.溴化氰法 CNBr,pH 11 4,pH 9.2 BBS 4,溴化氰法的特点： 活化效率高，速度快，配体结合量大，毒性大。（废液可用碱性硫酸亚铁中和） 主要影响因素： 活化： CNBr的用量，pH，温度，时间 偶联：配体的用量，pH，温度，时间，封闭,CNBr 活化的 Sephar

9、ose 4B商品 加有葡聚糖和乳糖的冷冻干燥粉,2.环氧氯丙烷法,|-OH + ClCH2 CH CH2 O 活化 2 Mol NaOH RT 16 20 hr |-O CH2 CH CH2 O 偶联 NH2 Pro. pH 9.5 RT 24 hr |-O CH2 CH CH2 NH Pro. | OH,手 臂 的连 接,接臂的方法： 1.手臂先接配体后偶联 2.手臂先偶联后接配体 NH2(CH2)nNH2 n=2 - 12 手臂的类型： 接手臂：,蛋白质偶联的特殊问题,在较低 pH 偶联可减少蛋白质与活化琼脂糖的多点结合。 配体浓度的测定： 差数分析 活化、偶联中应避免使用亲核基团的缓冲液：Tris (可用碳酸盐、磷酸盐和硼酸盐）。,柱层析条件的选择,平衡缓冲液的选择 样品体积、流速和时间 温度,五、分 离 实 验 技 术,1 胶 的 预 处 理