1.2基因工程的基本操作程序 (1).ppt

1、1.2基因工程的基本操作程序,基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,为什么要有“目的基因的获取”这一步？,有了目的基因，我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。,一、目的基因的获取,真核细胞的基因结构,什么是“目的基因” ？,原核细胞的基因结构,目的基因主要是_，也可以是一些具有调控作用的因子,编码蛋白质的结构基因,目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、种子贮藏蛋白基因及人胰岛素基因等。,1）从基因文库中获取目的基因,获得目的基因的方法,2）利用PCR技术扩增目的基因,未知目的

2、基因的核苷酸序列,已知目的基因的核苷酸序列,3）人工合成,且基因比较小,且基因比较大,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，称为基因文库。,1.基因文库概念,2.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类,种类,部分基因文库：只包含了一种生物的部分基因， 如：cDNA文库,基因组DNA文库：含有一种生物的全部基因,3、基因文库的构建,（1）基因组文库的构建,提取某生物 全部DNA,用适当 限制酶切割,许 多 DNA片段,与载体连接 导入受体菌群,该生物基 因组文库,（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）,（2）cDNA文库的构建m

3、RNA反转录形成,与载体连接 导入受体菌群,mRNA,逆转录酶,杂交双链,核酸酶H,单链DNA,DNA聚合酶,双链DNA (cDNA),该生物 cDNA文库,基因组DNA文库,cDNA文库,真核生物转录过程,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,某种生物部分基因,某种生物全部基因,小,大,无,有,无,有,可以,部分基因可以,村长, 为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的生物中提取不行吗？,当然行啊。构建基因文库只是获取目的基因的方法之一。但是，有时我们完全不知道目的基因序列，或者想从一种生物体内获得许多基因，或者想知道几种生物之间有哪些基因不同，或者想知道一种生物在不同的发育阶段都表达哪些

4、基因，或者想得到一种生物的全部基因序列，往往就需要构建基因文库。,4.基因文库的目的,1、 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术 通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因 因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外DNA扩增技术。,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,2、原理：,DNA复制,利用PCR技术扩增目的基因,四种脱氧核苷酸(dNTP),一对引物：,热稳定DNA聚合酶(Taq酶）,模板DNA( 需含有目的基因 ),4、条件：,一小段单链DNA或RNA，一般2030个碱基，能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。,已知目的基因的核苷酸序列,3、前提：,温度控制,PCR

5、扩增仪,5、方式：,指数,2n,6、结果：,使目的基因的片段在短时间内大量地扩增,以_方式扩增，即_（n为扩增循环的次数）,扩增过程,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下， 断裂，形成_,b、复性（55-60）：系统温度降低，引物 与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下，从 引物的5端3端延伸，合成与模板互补 的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,PCR仪,微量离心管,一 次 性 吸液枪头,调节轮,卸枪头按钮,推动按钮,卸枪头器,微量移液器,利用PCR技术扩增目的基因,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解

6、旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,通过DNA合成仪用化学方法人工合成,DNA合成仪,蛋白质的氨基酸顺序,mRAN 核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的 基因,推测,推测,合成,当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。,DNA合成仪,为什么要有“表达载体的构建”这一步？,单独的DNA片段目的基因是不能稳定遗传的。,构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用。,1.用一定的_切割载体，使其出现一个切口，露出_

7、。 2.用_切断目的基因，使其产生_。, 核心,3.将切下的目的基因片段插入载体的_处，再加入适量_，形成了一个重组DNA分子,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,相同的黏性末端,切口,DNA连接酶,二、基因表达载体的构建,基因表达载体的组成：,c 、目的基因,b、启动子,d 、终止子,e、标记基因,a、复制原点,启动子：位于基因的首端的一段特殊的DNA片断，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得蛋白质。,终止子：位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。,三、将目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞：,动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆

8、菌等。,将目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,转化,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,方法,导入植物细胞,导入动物细胞,导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法, 感受态细胞吸收DNA分子,农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上,基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体-DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,花粉管通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在

9、植物受粉后，花粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加表达载体-DNA ，使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,显微注射法,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,受精卵发育,新性状动物,2.微生物作受体细胞原因：,将目的基因导入微生物细胞,3.转化方法：,大肠杆菌,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,1.常用菌：,感受态大肠杆菌细胞,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。,DNA分子导入受体细胞后就说明目的基因完成了表达吗？,例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现

10、中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,(四)目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,分子 检测,个体 鉴定：,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交,抗原-抗体杂交,DNA,附着在膜上,硝化纤维素,加探针,含荧光素分子,变性,DNA杂交 （如检测SARS病毒等）,a,b,c,d,如果显示出杂交带，就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。,细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落

11、，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。,基因工程的基本操作程序,获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译、个体水平鉴定,思考：1.作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是： （1） 生物之间进行基因交流，只有

12、使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录；,（3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?,要选择合适的农杆菌菌株，因为不

13、是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物； 要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,酚类化合物,3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的

14、编码序列（cDNA）。 （2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。 （3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。 （4）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取-珠蛋白。,4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,1

15、.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容，正确的组合是,2、下列属于获取目的基因的方法的是( ) 利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取 从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成 A. B. C. D.,3.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因，该抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测 C增加质粒分子的分子量 D便于与外源基因连接 4. 有关基因工程的叙述正确的是 A限制酶只在获得目的基因时才用 B重组质粒的形成是在细胞内完成的 C质粒都可作为运载体 D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,5.哪项不是基因表达载体的组成部分( ) A.启动子 B.终止密码 C.标记基因 D.目的基因 6.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法( ) A基因枪法 B显微注射法 C.农杆菌转化法 D花粉管通道法,(多选)采用基因工程的方法培育抗虫棉，