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文档简介
1、1.2基因工程的基本操作程序,基因工程的基本操作程序,目的基因的获取,基因表达载体的构建,将目的基因导入受体细胞,目的基因的检测与鉴定,为什么要有“目的基因的获取”这一步?,有了目的基因,我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。,一、目的基因的获取,真核细胞的基因结构,什么是“目的基因” ?,原核细胞的基因结构,目的基因主要是_,也可以是一些具有调控作用的因子,编码蛋白质的结构基因,目前被广泛提取使用的目的基因有:苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因(抗病毒、抗细菌)、种子贮藏蛋白基因及人胰岛素基因等。,1)从基因文库中获取目的基因,获得目的基因的方法,2)利用PCR技术扩增目的基因,未知目的
2、基因的核苷酸序列,已知目的基因的核苷酸序列,3)人工合成,且基因比较小,且基因比较大,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同基因,称为基因文库。,1.基因文库概念,2.基因文库的分类:按外源DNA片段的来源分类,种类,部分基因文库:只包含了一种生物的部分基因, 如:cDNA文库,基因组DNA文库:含有一种生物的全部基因,3、基因文库的构建,(1)基因组文库的构建,提取某生物 全部DNA,用适当 限制酶切割,许 多 DNA片段,与载体连接 导入受体菌群,该生物基 因组文库,(每个受体菌含有一段不同的DNA片段),(2)cDNA文库的构建m
3、RNA反转录形成,与载体连接 导入受体菌群,mRNA,逆转录酶,杂交双链,核酸酶H,单链DNA,DNA聚合酶,双链DNA (cDNA),该生物 cDNA文库,基因组DNA文库,cDNA文库,真核生物转录过程,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,某种生物部分基因,某种生物全部基因,小,大,无,有,无,有,可以,部分基因可以,村长, 为什么要构建基因文库?直接从含有目的基因的生物中提取不行吗?,当然行啊。构建基因文库只是获取目的基因的方法之一。但是,有时我们完全不知道目的基因序列,或者想从一种生物体内获得许多基因,或者想知道几种生物之间有哪些基因不同,或者想知道一种生物在不同的发育阶段都表达哪些
4、基因,或者想得到一种生物的全部基因序列,往往就需要构建基因文库。,4.基因文库的目的,1、 概念:PCR全称为_,是一项 在生物_复制_的核酸合成技术 通过这项技术可在短时间内大量扩增目的基因 因为整个过程是在体外进行,所以又叫做体外DNA扩增技术。,聚合酶链式反应,体外,特定DNA片段,2、原理:,DNA复制,利用PCR技术扩增目的基因,四种脱氧核苷酸(dNTP),一对引物:,热稳定DNA聚合酶(Taq酶),模板DNA( 需含有目的基因 ),4、条件:,一小段单链DNA或RNA,一般2030个碱基,能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。,已知目的基因的核苷酸序列,3、前提:,温度控制,PCR
5、扩增仪,5、方式:,指数,2n,6、结果:,使目的基因的片段在短时间内大量地扩增,以_方式扩增,即_(n为扩增循环的次数),扩增过程,a、DNA变性(90-95):双链DNA模板 在热作用下, 断裂,形成_,b、复性(55-60):系统温度降低,引物 与DNA模板结合,形成局部_。,c、延伸(70-75):在Taq酶的作用下,从 引物的5端3端延伸,合成与模板互补 的_。,氢键,单链DNA,双链,DNA链,PCR仪,微量离心管,一 次 性 吸液枪头,调节轮,卸枪头按钮,推动按钮,卸枪头器,微量移液器,利用PCR技术扩增目的基因,碱基互补配对,四种脱氧核苷酸,模板、能量、酶,DNA在高温下变性解
6、旋,解旋酶催化,体外复制,细胞核内,热稳定的DNA聚合酶,细胞内的DNA聚合酶,大量的DNA片段,形成整个DNA分子,通过DNA合成仪用化学方法人工合成,DNA合成仪,蛋白质的氨基酸顺序,mRAN 核苷酸序列,基因DNA的核苷酸序列,目的 基因,推测,推测,合成,当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时,可采用此种方法。,DNA合成仪,为什么要有“表达载体的构建”这一步?,单独的DNA片段目的基因是不能稳定遗传的。,构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在,并且可以遗传给下一代,同时使目的基因能表达和发挥作用。,1.用一定的_切割载体,使其出现一个切口,露出_
7、。 2.用_切断目的基因,使其产生_。, 核心,3.将切下的目的基因片段插入载体的_处,再加入适量_,形成了一个重组DNA分子,限制酶,黏性末端,同一种限制酶,相同的黏性末端,切口,DNA连接酶,二、基因表达载体的构建,基因表达载体的组成:,c 、目的基因,b、启动子,d 、终止子,e、标记基因,a、复制原点,启动子:位于基因的首端的一段特殊的DNA片断,它是RNA聚合酶识别和结合的部位,有了它才能驱动基因转录出mRNA,最终获得蛋白质。,终止子:位于基因的尾端的一段特殊的DNA片断,能终止mRNA的转录。,三、将目的基因导入受体细胞,常用的受体细胞:,动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆
8、菌等。,将目的基因导入受体细胞的原理:,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,转化,目的基因进入_内,并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,方法,导入植物细胞,导入动物细胞,导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法, 感受态细胞吸收DNA分子,农杆菌特点:易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上,基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法,是利用压缩气体产生的动力,将包裹在金属颗粒表面的表达载体-DNA打入受体细胞中,使目的基因与其整合并表达的方法。,花粉管通道法,植物花粉在柱头上萌发后,花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在
9、植物受粉后,花粉形成的花粉管还未愈合前,剪去柱头,然后,滴加表达载体-DNA ,使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,显微注射法,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,受精卵发育,新性状动物,2.微生物作受体细胞原因:,将目的基因导入微生物细胞,3.转化方法:,大肠杆菌,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,1.常用菌:,感受态大肠杆菌细胞,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,不能,受体细胞必须表现出特定的性状,才能说明目的基因完成了表达。,DNA分子导入受体细胞后就说明目的基因完成了表达吗?,例:用棉铃饲喂棉铃虫,如虫吃后不出现
10、中毒症状,说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡,则说明摄入了抗虫基因并得到表达。,(四)目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,分子 检测,个体 鉴定:,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交,抗原-抗体杂交,DNA,附着在膜上,硝化纤维素,加探针,含荧光素分子,变性,DNA杂交 (如检测SARS病毒等),a,b,c,d,如果显示出杂交带,就表明待测样品含有目的基因或目的基因已经转录。,细菌的检测,将每个受体细胞单独培养形成菌落
11、,检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落,保留有表达产物的进一步培养、研究。,基因工程的基本操作程序,获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、基因枪法、显微注射法 目的基因的检测与鉴定 检测:是否插入、转录、翻译、个体水平鉴定,思考:1.作为基因工程表达载体,只需含有目的基因就可以完成任务吗?为什么?,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用,还需要有其他控制元件,如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是: (1) 生物之间进行基因交流,只有
12、使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达; (2) 通过cDNA文库获得的目的基因没有启动子,只将编码序列导入受体生物中无法转录;,(3) 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记; (4) 为了增强目的基因的表达水平,往往还要增加一些其他调控元件,如增强子等; (5) 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位,往往要加上可以标识存在部位的基因(或做成目的基因与标识基因的融合基因),如绿色荧光蛋白基因等。,2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?,要选择合适的农杆菌菌株,因为不
13、是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物; 要加趋化和诱导的物质,一般为乙酰丁香酮等,目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢(趋化性)和激活农杆菌的Vir区(诱导)的基因,使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,酚类化合物,3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素,联系前面有关细胞器功能的知识,结合基因工程操作程序的基本思路,思考一下,若要生产人的糖蛋白,可以用大肠杆菌吗?,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链,这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的,内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中,大肠杆菌不存在这两种细胞器,因此,在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,(1)从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的
14、编码序列(cDNA)。 (2)将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子,另外加上抗四环素的基因,构建成一个表达载体。 (3)将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中,然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中,大肠杆菌会因不含有抗四环素基因而死掉;如果培养基上长出大肠杆菌菌落,则表明-珠蛋白基因已进入其中。 (4)培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌,收集菌体,破碎后从中提取-珠蛋白。,4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时,动物有可能患某种疾病,如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法,使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白,想一想,应如何进行设计?,1
15、.下表关于基因工程中有关基因操作的名词及对应的内容,正确的组合是,2、下列属于获取目的基因的方法的是( ) 利用mRNA反转录形成从基因组文库中提取 从受体细胞中提取 利用PCR技术 利用DNA转录 人工合成 A. B. C. D.,3.细菌的质粒分子带有一个抗菌素抗性基因,该抗性基因在基因工程中的主要作用是 A提高受体细胞在自然环境中的耐药性 B有利于对目的基因是否导入进行检测 C增加质粒分子的分子量 D便于与外源基因连接 4. 有关基因工程的叙述正确的是 A限制酶只在获得目的基因时才用 B重组质粒的形成是在细胞内完成的 C质粒都可作为运载体 D蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,5.哪项不是基因表达载体的组成部分( ) A.启动子 B.终止密码 C.标记基因 D.目的基因 6.下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法( ) A基因枪法 B显微注射法 C.农杆菌转化法 D花粉管通道法,(多选)采用基因工程的方法培育抗虫棉,
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