发酵生理第二部分微生物的代谢.ppt

1、第二部分 微生物的代谢,生物大分子降解为小分子 代谢中间体-丙酮酸 TCA环 发酵与呼吸 代谢中能量的释放与利用 合成代谢 次级代谢与调节 代谢控制发酵 发酵工艺基础知识,生物大分子分解,微生物发酵基质主要包括淀粉、蛋白质、纤维素、果胶、核酸、脂类等,淀粉,淀粉酶,液化型 糖化型,（a淀粉酶）,葡糖生成酶,淀粉酶,异淀粉酶,葡萄糖,1、,（淀粉1，4葡萄糖苷酶）,（淀粉1，6葡萄糖苷酶）,（淀粉1，4麦芽糖苷酶）,工业上常用的碳源（carbon source） 1.谷物淀粉（玉米、马铃薯、木薯淀粉） 应用最广。 使用条件： 微生物必须能分泌水解淀粉、糊精的酶类。,缺点： a.难利用、发酵液比较

2、稠、一般2.0%时加入 一定的-淀粉酶。 b.成分较复杂，有直链淀粉和支链淀粉等。 优点： 来源广泛、价格低，可解除葡萄糖效应。,2. 葡萄糖 所有的微生物都能利用葡萄糖，但会引起葡萄糖效应。 工业上常用淀粉水解糖,但是糖液必须达到一定的质量指标。,DE值：dextrose equivalent value （葡萄糖当量值） 表示淀粉糖的含糖量。 还原糖含量（） DE值 100 干物质含量（）,淀粉水解糖的制备方法及原理 （一）酸解法（acid hydrolysis method） 以酸为催化剂，在高温高压下使淀粉水解生成葡萄糖的方法。,1.水解过程： 总反应式： (C6H10O5)n+nH2

3、O nC6H12O6 过程：(C6H10O5)n (C6H10O5)x C12H22O11 C6H12O6 淀粉 糊精 麦芽糖 葡萄糖 H+对作用点无选择性，-1,4-糖苷键和-1,6-糖苷键均被切断。,评价 优点：工艺简单，水解时间短，生产效率高，设备周转快。 缺点： （1）副产物多，影响糖液纯度，一般DE值只有90左右。 （2）对淀粉原料要求严格，不能用粗淀粉，只能用纯度较高的精制淀粉。,淀粉 葡萄糖 复合二糖 5羟甲基糠醛 复合低聚糖 有机酸、有色物质 损失葡萄糖量 7 1,复合反应,分解反应,盐酸,酶解法（enzyme hydrolysis method） 用专一性很强的淀粉酶及糖化酶

4、将淀粉水解为葡萄糖的工艺。,分两步： （1）液化：用-淀粉酶将淀粉转化为糊精和低聚糖（2）糖化：用糖化酶（又称葡萄糖淀粉酶）将糊精 和低聚糖转化为葡萄糖。 所以，淀粉的液化和糖化均在酶作用下进行，又称双酶法(double enzyme hydrolysis method)。,液化（liquification） 淀粉酶水解底物内部的1,4糖苷键，不能水解1,6糖苷键，一般采用耐高温淀粉酶，使液化速度加快。8590度 。,液化程度的控制（液化后需糖化的原因） 糖液的DE值低（-淀粉酶不能水解-1,6糖苷键） 液化在较高温度下进行，液化时间加长，淀粉老化，使糖化酶难以利用。 糖化酶水解的底物分子要求

5、有一定的大小范围。,根据生产经验，DE值在2030之间为好，液化终点可通过碘液判断，此时呈棕色。,2. 糖化（saccharification） 糖化酶从非还原性末端水解-1,4糖苷键和-1,6糖苷键。 终点确定：DE值达最高时，停止酶反应。,3.评价 优点： （1）反应条件温和，不需高温、高压设备。 （2）副反应少，水解糖液纯度高。 （3）对原料要求粗放，可用粗原料并在较高淀粉乳浓 度下水解。 （4）糖液颜色浅，质量高。,缺点： （1）生产周期长，一般需要48小时。 （2）需要更多的设备，且操作严格。,（三）酸酶结合法 （acid-enzyme hydrolysis method） 集酸解法

6、和酶解法的优点而采取的生产工艺。根据原料淀粉性质分：,酸酶法：先将淀粉酸水解成糊精和低聚糖，再用糖化酶将其水解为葡萄糖。 适用：淀粉颗粒坚硬（如玉米、小麦）的原料，若用-淀粉酶液化，短时间液化，反应往往不彻底。,2.酶酸法：先用-淀粉酶液化，再用酸水解。 适用：颗粒大小不一（如碎米淀粉）的淀粉原料，若用酸法，则水解不均匀。,（四）不同糖化工艺的比较,2. 纤维素的降解 纤维素是自然界中最丰富的可再生资源，占地球总生物量的40%，它也是地球生物圈碳素和能量循环的主要部分。由于纤维素具有水不溶性的高结晶构造，其外围又被木质素层包围着，要把它水解成可利用的葡萄糖相当困难，所以到目前为止仍没有得到很好

7、地利用。 近几年随着原油价格的不断攀升，纤维素资源的利用引起了世界各国的极大关注和高度重视。我国出于对能源战略的考虑，近几年也加大了对纤维素利用的研究的投入。 （1）纤维素的结构 天然纤维素是由D-吡喃式葡萄糖通过-1,4-糖苷键结合形成的线形长链分子，约由700-150,000个左右的残基所构成，一般在3000个左右。,通过分子间的氢键(O3-HO5 and O6 H-O2) 和分子链间的氢键 (O6-H O3) 形成网状平面 并通过疏水面的堆积构成纤维素的晶体结构。,O3-HO5,O6 H-O2,O6-H O3,天然纤维素除了我们上面提到的结晶结构外，还有非结晶区。如下图。,结晶区,无定形

8、区,微生物降解纤维素的酶系 降解和利用水不溶性的纤维素，微生物必须产生相应的酶。在过去二十几年里，根据酶对纤维素作用方式的研究，将纤维素降解的酶类分成三类： (i) 纤维素内切酶 endoglucanases or 1,4-D-glucan-4-glucanohydrolases (EC 3.2.1.4) (ii) 纤维素外切酶 exoglucanases, including 1,4-D-glucan glucanohydrolases (also known as cellodextrinases) (EC 3.2.1.74) and 1,4Dglucan cellobiohydrolas

9、es (cellobiohydrolases) (EC 3.2.1.91) (iii) 葡萄糖苷酶-glucosidases or -glucoside glucohydrolases (EC3.2.1.21). 纤维素内切酶随机在纤维素的无定形区将糖链切断，产生新的链端。纤维素外切酶作用于纤维素链的两端产生纤维二糖。葡萄糖苷酶降解纤维素湖精和纤维二糖为葡萄糖。,教材上也将纤维素酶分为三种C1酶、 CX酶及葡萄糖苷酶,天然纤维素 短链纤维素,葡萄糖,纤维二糖,纤维寡糖,纤维二糖,葡萄糖,C1酶,CX酶,葡萄糖苷酶,by Small Angle X-ray Scattering. J.Biol.

10、Chem. Vol. 277 pp. 4088740892, 2002,纤维素酶的结构可以分成三个部分：催化结构域、吸附结构域和连接肽。 纤维素酶对纤维素的作用是一个识别、吸附和催化的过程。,纤维素酶的结构和作用机理,3、果胶,半乳糖醛酸以a-1，4糖苷键形成的直链高分子化合物，常带有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等组成的侧链，游离的羧基部分或全部与钙、钾、钠离子，特别是与硼化合物结合在一起,75%羧基甲基化成甲酯,从广义上讲，果胶酶可以被分为3种类型：原果胶酶：可以把不溶于水的原果胶分解为可溶于水的高聚合体果胶；果胶甲酯水解酶：脱去果胶中的甲氧基基团，促使果胶的脱甲酯作用；果

11、胶聚半乳糖醛酸（解聚酶）：促使果胶中D-半乳糖醛酸的-1，4糖苷键的裂解。,目前国内外研究和应用较多的果胶酶产生菌是细菌和霉菌，也有链霉菌产生果胶酶的报道。在细菌中，欧文氏杆菌(Erwinia sp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)、节杆菌 (Arthrobacter sp.)和假单胞杆菌(Pseodomonas sp.)都产生果胶酶。嗜碱性芽孢杆菌属和欧文氏杆菌属主要用于在苎麻和红麻的脱胶、生物制浆及污物的处理软化等方面，应用前景可观，受到较多的关注和研究。已见报道的产果胶酶的霉菌种类大约包括20个属， 如曲霉属(Aspergillus sp.)、灰霉菌属(Botrytis sp.)

12、、镰孢菌属(Fusarium sp.)、炭疽菌属(Colletotrichum sp.)、核盘菌属(Scletorium sp.)和玉圆斑菌属(Cochliobolus sp.)等。目前，黑曲霉、根霉和盾壳霉作为产果胶酶的菌株已经商品化。国内外对霉菌发酵产果胶酶的研究主要集中在曲霉属中，而曲霉属中研究最多的是黑曲霉。其原因是，果胶酶被广泛应用于食品工业中，如用于果汁、果酒及中药营养液的深加工等，使得产品质量和外观得以改善，而生产食品酶制剂的菌株必须是安全菌株。黑曲霉分泌的胞外酶系较全，不仅可以产生大量果胶酶，而且黑曲霉属于安全菌株。另外，黑曲霉产生的果胶酶最适pH值一般在酸性范围内，这也是其被

13、应用于食品工业行业中的原因之一,研究进展,果胶酶,微生物来源蛋白酶制剂常按最适pH分类 碱性：pH10以上（2709枯草菌蛋白酶） 酸性：pH2-3以下 黑曲霉 中性：多 蛋白酶分类：,内肽酶 （蛋白酶） 外肽酶 羧肽酶、氨肽酶,蛋白酶按活性中心可分为丝氨酸蛋白酶、天门冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶；按最适pH值来分又分酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶,葡萄糖 丙酮酸 CO2和H2O,蛋白、核酸降解自己了解（教材或生物化学）,生物大分子,微生物小分子代谢的中间体丙酮酸,葡萄糖,酵解途径,丙酮酸,乳酸、氨基酸、甘油,糖原,核糖 + NADPH+H+,磷酸戊糖途径,淀粉 纤维素,丙酮酸

14、位于无氧分解和有氧分解的交界点上，是糖代谢中具有关键作用的中间产物 从丙酮酸可直接生成丙氨酸，因为它可以与氨基转移反应相结合，故在氮代谢方面也起着重要的作用 和CoA反应能形成乙酰CoA，与脂肪酸的代谢也有重要的关系 因此，丙酮酸在三大营养物质的代谢联系中起着重要的枢纽作用,从代谢的角度看丙酮酸,需要掌握的知识,发酵 (fermentation),呼吸作用,氧化磷酸化, 底物水平磷酸化,新陈代谢,同型乳酸发酵, 异型乳酸发酵,双歧杆菌发酵 葡糖分解为丙酮酸的途径 EMP途径特点、关键酶 HMP途径的重要意义、关键酶 ED途径的特点、关键酶 磷酸己糖酮解途径的特点、关键酶 TCA循环的重要特点,

15、单糖分解为丙酮酸的四（五）种途径,分解葡萄糖生成丙酮酸的过程 糖酵解在胞浆中进行 葡糖糖需磷酸活化 1分子葡萄糖经酵解可净生成2分子ATP 是细胞摄入体内的葡萄糖最初经历的酶促分解过程，也是葡萄糖分解代谢所经历的共同途径 是机体在缺氧情况下迅速获得能量的主要途径，也是成熟红细胞获得能量的唯一途径 糖酵解是肿瘤细胞能量代谢的主要方式,关于糖酵解的认识,EMP途径绝大多数微生物均存在,连接TCA、HMP、ED等途径的桥梁,提供ATP和NAD(P)H HMP戊糖代谢，提供NADPH 和碳骨架 ED 不依赖上面两途径单独纯在，补偿途径 PK and HK 某些细菌中,（一）EMP途径,葡萄糖的 酵解作

16、用 ( 又称：Embden -Meyerhof -Parnas途径， 简称：EMP途径),活化,移位,氧化,磷酸化,葡萄糖激活的方式,己糖异构酶,磷酸果糖激酶,果糖二磷酸醛缩酶,甘油醛-3-磷酸脱氢酶,磷酸甘油酸激酶,甘油酸变位酶,烯醇酶,丙酮酸激酶,EMP途径特点：,葡萄糖分子经转化成1，6二磷酸果糖后，在醛缩酶的催化下，裂解成两个三碳化合物分子，即磷酸二羟丙酮和3-磷酸甘油醛。 3-磷酸甘油醛被进一步氧化生成2分子丙酮酸， 1分子葡萄糖可降解成2分子3-磷酸甘油醛，并消耗2分子ATP。2分子3-磷酸甘油醛被氧化生成2分子丙酮酸，2分子NADH2和4分子ATP。,EMP途径关键步骤,1. 葡

17、萄糖磷酸化1.6二磷酸果糖(耗能) 2. 1.6二磷酸果糖2分子3-磷酸甘油醛 3. 3-磷酸甘油醛丙酮酸 总反应式： 葡萄糖+2NAD+2Pi+2ADP 2丙酮酸+2NADH2+2ATP CoA 丙酮酸脱氢酶 乙酰CoA， 进入TCA,葡萄糖激活的方式,好氧微生物：通过需要Mg+和ATP的己糖激酶 厌氧微生物：通过磷酸烯醇式丙酮酸-磷酸转移酶系统，在葡萄糖进入细胞时即完成了磷酸化,磷酸果糖激酶,EMP途径的关键酶， 需要ATP和Mg+ 在活细胞内催化的反应是不可逆的反应,耗能阶段 C6 2C3 产能阶段 4 ATP 2ATP 2C3 2 丙酮酸 2NADH2 C6H12O6+2NAD+2AD

18、P+2Pi 2CH3COCOOH+2NADH2+2H+2ATP+2H2O,EMP途径的总反应,（二） HMP途径 (戊糖磷酸途径) （Hexose Monophophate Pathway）,HMP途径： 葡萄糖经转化成6-磷酸葡萄糖酸后，在6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶的催化下，裂解成5-磷酸戊糖和CO2。 磷酸戊糖进一步代谢有两种结局， 磷酸戊糖经转酮转醛酶系催化，又生成磷酸己糖和磷酸丙糖（3-磷酸甘油醛），磷酸丙糖借EMP途径的一些酶，进一步转化为丙酮酸。 称为不完全HMP途径。 由六个葡萄糖分子参加反应，经一系列反应，最后回收五个葡萄糖分子，消耗了1分子葡萄糖（彻底氧化成CO2 和水），称完全

19、HMP途径。,HMP途径降解葡萄糖的三个阶段,HMP是一条葡萄糖不经EMP途径和TCA循环途径而得到彻底氧化，并能产生大量NADPH+H+形式的还原力和多种中间代谢产物的代谢途径 1. 葡萄糖经过几步氧化反应产生核酮糖-5-磷酸和CO2 2. 核酮糖-5-磷酸发生同分异构化或表异构化而分别产生核糖-5-磷酸和木酮糖-5-磷酸 3.上述各种戊糖磷酸在无氧参与的情况下发生碳架重排，产生己糖磷酸和丙糖磷酸,HMP途径关键步骤：,1. 葡萄糖6-磷酸葡萄糖酸 2. 6-磷酸葡萄糖酸5-磷酸核酮糖 5-磷酸木酮糖 5-磷酸核糖参与核酸生成 3. 5-磷酸核酮糖6-磷酸果糖+3-磷酸甘油醛(进入EMP,6

20、 葡萄糖-6-磷酸+12NADP+6H2O 5 葡萄糖-6-磷酸+12NADPH+12H+12CO2+Pi,HMP途径的总反应,HMP途径的重要意义,为核苷酸和核酸的生物合成提供戊糖-磷酸。 产生大量NADPH2，一方面为脂肪酸、固醇等物质的合成提供还原力，另方面可通过呼吸链产生大量的能量。 与EMP途径在果糖-1，6-二磷酸和甘油醛-3-磷酸处连接，可以调剂戊糖供需关系。 途径中的赤藓糖、景天庚酮糖等可用于芳香族氨基酸合成、碱基合成、及多糖合成。 途径中存在37碳的糖，使具有该途径微生物的所能利用利用的碳源谱更为更为广泛。 通过该途径可产生许多种重要的发酵产物。如核苷酸、若干氨基酸、辅酶和乳

21、酸（异型乳酸发酵）等。 HMP途径在总的能量代谢中占一定比例，且与细胞代谢活动对其中间产物的需要量相关。,又称2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡糖酸（KDPG）裂解途径。 1952年在Pseudomonas saccharophila中发现，后来证明存在于多种细菌中（革兰氏阴性菌中分布较广）。 ED途径可不依赖于EMP和HMP途径而单独存在，是少数缺乏完整EMP途径的微生物的一种替代途径，未发现存在于其它生物中。,（三）ED途径,ED途径,ATP ADP NADP+ NADPH2 葡萄糖 6-磷酸-葡萄糖 6-磷酸-葡萄酸 激酶 （与EMP途径连接） 氧化酶 (与HMP途径连接) EMP途径 3-磷

22、酸-甘油醛 脱水酶 2-酮-3-脱氧-6-磷酸-葡萄糖酸 EMP途径 丙酮酸 醛缩酶 有氧时与TCA环连接 无氧时进行细菌发酵,ED途径,ED途径,ED途径的特点,葡萄糖经转化为2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸后，经脱氧酮糖酸醛缩酶催化，裂解成丙酮酸和3-磷酸甘油醛， 3-磷酸甘油醛再经EMP途径转化成为丙酮酸。结果是1分子葡萄糖产生2分子丙酮酸，1分子ATP。 ED途径的特征反应是关键中间代谢物2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸（KDPG）裂解为丙酮酸和3-磷酸甘油醛。ED途径的特征酶是KDPG醛缩酶. 反应步骤简单，产能效率低. 此途径可与EMP途径、HMP途径和TCA循环相连接，可互相

23、协调以满足微生物对能量、还原力和不同中间代谢物的需要。好氧时与TCA循环相连，厌氧时进行乙醇发酵.,ED途径的总反应,ATP C6H12O6 ADP KDPG ATP 2ATP NADH2 NADPH2 2丙酮酸 6ATP 2乙醇 (有氧时经过呼吸链) （无氧时进行细菌乙醇发酵）,ED途径的总反应,关键反应：2-酮-3-脱氧-6-磷酸葡萄糖酸的裂解 催化的酶：6-磷酸脱水酶，KDPG醛缩酶 相关的发酵生产：细菌酒精发酵 优点：代谢速率高，产物转化率高，菌体生成少，代谢副产物少，发酵温度较高，不必定期供氧。 缺点：pH5，较易染菌；细菌对乙醇耐受力低,ATP 有氧时经呼吸链 6ATP 无氧时 进

24、行发酵 2乙醇,2ATP NADH+H+ NADPH+H+ 2丙酮酸,ATP C6H12O6KDPG,ED途径的总反应（续）,由表可见，在微生物细胞中，有的同时存在多条途径来降解葡萄糖，有的只有一种。在某一具体条件下，拥有多条途径的某种微生物究竟经何种途径代谢，对发酵产物影响很大。,（四）磷酸酮解途径,存在于某些细菌如明串珠菌属和乳杆菌属中的一些细菌中。 进行磷酸酮解途径的微生物缺少醛缩酶，所以它不能够将磷酸己糖裂解为2个三碳糖。 磷酸酮解酶途径有两种： 磷酸戊糖酮解途径（PK）途径 磷酸己糖酮解途径（HK）途径,葡萄糖 6-P-葡萄糖 6-P-葡萄糖酸 5 -P-核酮糖 5 -P-木酮糖,3

25、 -P-甘油醛 丙酮酸,乙酰磷酸 乙酰CoA 乙醛,ATP,ADP,NAD+,NADH+H+,CO2,乳酸,乙醇,异构化作用,NAD+,NADH+H+,磷酸戊糖酮解酶,CoA,Pi,2ADP+Pi,2ATP,-2H,-2H,-2H,NAD+,NADH+H+,磷酸戊糖酮解途径,磷酸戊糖酮解途径的特点:,分解1分子葡萄糖只产生1分子ATP，相当于EMP途径的一半; 几乎产生等量的乳酸、乙醇和CO2,磷酸己糖解酮途径,2葡萄糖 2葡萄糖-6-磷酸 6-磷酸果糖 6-磷酸-果糖,4-磷酸-赤藓糖 乙酰磷酸,2木酮糖-5-磷酸,2甘油醛 -3-磷酸 2乙酰磷酸,2乳酸,2乙酸,乙酸,磷酸己糖解酮酶,磷酸

26、己糖解酮酶戊,逆HMP途径,同EMP,乙酸激酶,磷酸己糖酮解途径的特点：,有两个磷酸酮解酶参加反应； 在没有氧化作用和脱氢作用的参与下，2分子葡萄糖分解为3分子乙酸和2分子3-磷酸-甘油醛， 3-磷酸-甘油醛在脱氢酶的参与下转变为乳酸；乙酰磷酸生成乙酸的反应则与ADP生成ATP的反应相偶联； 每分子葡萄糖产生2.5分子的ATP； 许多微生物（如双歧杆菌）的异型乳酸发酵即采取此方式。,研究问题：代谢流分析,Metabolic flux analysis is an analysis technique similar to Flux Balance Analysis used to determ

27、ine the rate at which a metabolite is produced during a bioprocess. Metabolic flux analysis (MFA) is widely used to quantify metabolic pathway activity 代谢物流分析是代谢工程的重要分析技术，通过计算各种途径的活性，尤其与代谢物的生产研究有关途径的定量，使尽可能多的碳从基质流向代谢产物。,酵母型酒精发酵 同型乳酸发酵 丙酸发酵 混合酸发酵 2,3丁二醇发酵 丁酸发酵,丙酮酸的发酵产物,微生物能在不同条件下对不同物质或基本相同的物质进行不同的发酵，

28、不同微生物对不同物质发酵可以得到不同的产物；不同微生物对同一物质进行发酵，或同一微生物在不同条件下进行发酵都可以得到不同的产物，所有这些都取决于微生物自身的代谢特点和发酵条件。,（一）乙醇发酵,细菌的乙醇发酵 菌种：运动发酵单胞菌等 途径：ED 酵母菌（在pH3.5-4.5时）的乙醇发酵 脱氢酶 脱羧酶 丙酮酸 乙醛 乙醇 通过EMP途径产生乙醇，总反应式为： C6H12O6+2ADP+2Pi 2C2H5OH+2CO2+2ATP,C6H12O6 2CH3COCOOH 2CH3CHO 2CH3CH2OH,NAD,NADH2,-2CO2,EMP,2ATP,乙醇脱氢酶,酵母菌的乙醇发酵：,概念 菌种

29、 途径 特点 发生条件,该乙醇发酵过程只在pH3.54.5以及厌氧的条件下发生，又称第一型发酵。,通过EMP途径产生乙醇，总反应式为： C6H12O6+2ADP+2Pi 2C2H5OH+2CO2+2ATP,当发酵液处在碱性条件（PH7.6）下，酵母的乙醇发酵会改为第三型发酵（甘油发酵）。 原因：该条件下产生的乙醛不能作为正常受氢体，结果2分子乙醛间发生歧化反应，生成1分子乙醇和1分子乙酸； CH3CHO+H2O+NAD+ CH3COOH+NADH+H+ CH3CHO+NADH+H+ CH3CH2OH+ NAD+,在适量的亚硫酸盐（3%）可进行第二型发 酵生成甘油，亚硫酸氢钠和乙醛反应，生成难溶

30、的磺化羟基乙醛。,迫使磷酸二羟丙酮担任受氢体接受3-磷酸甘油醛脱下的氢而生成 -磷酸甘油，后者经-磷酸甘油酯酶催化，生成甘油。,2葡萄糖 2甘油+乙醇+乙酸+2CO2,细菌的乙醇发酵,葡萄糖,2-酮-3-脱氧-6-磷酸-葡萄糖酸,3-磷酸甘油醛 丙酮酸,丙酮酸,乙醛 乙醛,2乙醇,2CO2,2H,2H,+ATP,2ATP,菌种：运动发酵单胞菌等 途径：ED,酵母菌（在pH3.5-4.5时）的乙醇发酵 脱羧酶 脱氢酶 丙酮酸 乙醛 乙醇 通过EMP途径产生乙醇，总反应式为： C6H12O6+2ADP+2Pi 2C2H5OH+2CO2+2ATP 细菌(Zymomonas mobilis)的乙醇发酵

31、 通过ED途径产生乙醇，总反应如下： 葡萄糖+ADP+Pi 2乙醇+2CO2+ATP 细菌(Leuconostoc mesenteroides)的乙醇发酵 通过HMP途径产生乙醇、乳酸等，总反应如下： 葡萄糖+ADP+Pi 乳酸+乙醇+CO2+ATP 同型乙醇发酵：产物中仅有乙醇一种有机物分子的酒精发酵 异型乙醇发酵：除主产物乙醇外，还存在有其它有机物分子的发酵,利用Z.mobilis等细菌生产酒精,优点：代谢速率高；产物转化率高；菌体生成少 代谢副产物少；发酵温度高；,缺点：pH5较易染菌；耐乙醇力较酵母低,（二）乳酸发酵,乳酸细菌能利用葡萄糖及其他相应的可发酵的糖产生乳酸，称为乳酸发酵。

32、由于菌种不同，代谢途径不同，生成的产物有所不同，将乳酸发酵又分为同型乳酸发酵、异型乳酸发酵和双歧杆菌发酵。 同型乳酸发酵：（经EMP途径） 异型乳酸发酵：（经HMP途径） 双歧杆菌发酵: （经HK途径磷酸己糖解酮酶途径）,葡萄糖,3-磷酸甘油醛,磷酸二羟丙酮,2( 1,3-二-磷酸甘油酸）,2乳酸 2丙酮酸,同型乳酸发酵,2NAD+ 2NADH,4ATP,4ADP,2ATP 2ADP,Lactococcus lactis Lactobacillus plantarum,概念 菌种 途径 特点,异型乳酸发酵：,葡萄糖,6-磷酸葡萄糖,6-磷酸葡萄糖酸,5-磷酸木酮糖,3-磷酸甘油醛,乳酸,乙酰磷

33、酸,NAD+ NADH,NAD+ NADH,ATP ADP,乙醇 乙醛 乙酰CoA,2ADP 2ATP,-2H,概念 菌种 途径 特点,-CO2,（三）混合酸发酵,概念：埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌属的一些菌通过EMP途径将葡萄糖转变成琥珀酸、乳酸、甲酸、乙醇、乙酸、H2和CO2等多种代谢产物，由于代谢产物中含有多种有机酸，故将其称为混合酸发酵。 发酵途径：,葡萄糖 琥泊酸 草酰乙酸 磷酸烯醇式丙酮酸 乳酸 丙酮酸 乙醛 乙酰 CoA 甲酸 乙醇 乙酰磷酸 CO2 H2 乙酸,丙酮酸甲酸裂解酶,乳酸脱氢酶,甲酸-氢裂解酶,磷酸转乙酰酶,乙酸激酶,PEP羧化酶,乙醛脱氢酶,+2H,pH6.2,（

34、四）2,3-丁二醇发酵,葡萄糖 乳酸 丙酮酸 乙醛 乙酰CoA 甲酸 乙醇 乙酰乳酸 二乙酰 3-羟基丁酮 2,3-丁二醇,CO2 H2,-乙酰乳酸合成酶,-乙酰乳酸脱羧酶,2,3-丁二醇脱氢酶,概念：肠杆菌、沙雷氏菌、和欧文氏菌属中的一些细菌具有-乙酰乳酸合成酶系而进行丁二醇发酵。 发酵途径：,EMP,TCA,（五） TCA循环,三羧酸循环,丙酮酸在进入三羧酸循环之先要脱羧生成乙酰CoA，乙酰CoA和草酰乙酸缩合成柠檬酸再进入三羧酸循环。 循环的结果是乙酰CoA被彻底氧化成CO2和H2O，每氧化1分子的乙酰CoA可产生12分子的ATP，草酰乙酸参与反应而本身并不消耗。,TCA循环在微生物代谢

35、中的枢纽地位,糖类,葡萄糖,丙酮酸,乙酰-CoA,乙醇,乳酸,丙酮,丁醇,丁二醇,EMP,B-氧化,脂肪,甘油,脂肪酸,蛋白质,氨基酸,TCA,ATP，各种 有机 酸 ，天冬氨酸，柠檬酸，谷氨酸,TCA循环中需要关注的地方,1、 TCA环的三步反映不可逆 2、三个关键酶 3、四步脱氢，二步脱羧反应 4、总反应： Acetyl-CoA + 3 NAD+ + FAD + GDP + Pi + 3 H2O CoA-SH + 3 NADH + 3 H+ + FADH2 + GTP + 2 CO2 5、TCA必须在有氧条件下才能进行,TCA循环的重要特点,1、循环一次的结果是乙酰CoA的乙酰基被氧化为2

36、分子CO2,并重新生成1分子草酰乙酸； 2、整个循环有四步氧化还原反应，其中三步反应中将NAD+还原为NADH+H+，另一步为FAD还原； 3、为糖、脂、蛋白质三大物质转化中心枢纽。 4、循环中的某些中间产物是一些重要物质生物合成的前体； 5、生物体提供能量的主要形式； 6、为人类利用生物发酵生产所需产品提供主要的代谢途径。如 柠檬酸发酵；Glu发酵等。,回补途径,三羧酸循环不仅是产生ATP的途径，它产生的中间产物也是生物合成的前体。例如卟啉的主要碳原子来自琥珀酰CoA，谷氨酸、天冬氨酸是从-酮戊二酸、草酰乙酸衍生而成。一旦草酰乙酸浓度下降，势必影响三羧酸循环的进行。,1.丙酮酸羧化支路,丙酮

37、酸羧化酶最先在细菌中发现，后来证明动物、植物、微生物中普遍存在。该酶是寡聚酶，有4个亚基，各需一分子生物素和一个二价金属离子（Mg2+）作辅基，乙酰CoA是其变构激活剂，反应需要ATP供能。,细菌中还有磷酸烯醇式丙酮酸羧化激酶，可催化磷酸烯醇式丙酮酸羧化生成草酸乙酸。在植物、人大脑和心脏中也存在这个反应。,苹果酸酶是真核细胞中的一种酶，它催化丙酮酸还原羧化成苹果酸，反应不需要ATP，但需要 NADHH+。,乙醛酸循环（TCA支路）,关键酶：异柠檬酸裂解酶和苹果酸合成酶。 二碳化合物（乙酸）的同化，葡萄糖通过抑制异柠檬酸裂解酶而抑制乙醛酸循环 普遍存在于好氧微生物，（乙酰CoA合成酶）,甘油酸途

38、径,甘氨酸、乙醇酸和草酸 另一种利用二碳化合物的途径，提供TCA中间产物 由乙醛酸生成甘油的途径。特征酶 乙醛酸连接酶，羟基丙酸半醛还原酶,其他TCA中间产物来源,二、递氢、受氢和ATP的产生,经上述脱氢途径生成的NADH、NADPH、FAD等还原型辅酶通过呼吸链等方式进行递氢，最终与受氢体（氧、无机或有机氧化物）结合，以释放其化学潜能。 根据递氢特别是受氢过程中氢受体性质的不同,把微生物能量代谢分为呼吸作用和发酵作用两大类.,发酵作用：没有任何外援的最终电子受体时，以底物水平磷酸化方式产生ATP的生物学过程； 呼吸作用：有外援的最终电子受体的生物氧化模式； 呼吸作用又可分为两类： 有氧呼吸最

39、终电子受体是分子氧O2; 无氧呼吸最终电子受体是O2以外的 无机氧化物，如NO3-、SO42-等.,概念：在生物氧化中发酵是指无氧条件下，底物脱氢后所产生的还原力不经过呼吸链传递而直接交给一内源氧化性中间代谢产物的一类低效产能反应。在发酵工业上，发酵是指任何利用厌氧或好氧微生物来生产有用代谢产物的一类生产方式。 发酵途径：葡萄糖在厌氧条件下分解葡萄糖的产能途径主要有EMP、HMP、ED、WD （HK和PK）途径。 发酵类型：在上述途径中均有还原型氢供体NADH+H+和NADPH+H+产生，但产生的量并不多，如不及时使它们氧化再生，糖的分解产能将会中断，这样微生物就以葡萄糖分解过程中形成的各种中

40、间产物为氢（电子）受体来接受NADH+H+和NADPH+H+的氢（电子），于是产生了各种各样的发酵产物。根据发酵产物的种类有乙醇发酵、乳酸发酵、丙酸发酵、丁酸发酵、混合酸发酵、丁二醇发酵、及乙酸发酵等。,1、发酵作用,EMP生物学意义： 是葡萄糖在生物体内进行有氧或无氧分解的共同途径,通过糖酵解，生物体获得生命活动所需要的能量； 形成多种重要的中间产物，为氨基酸、脂类合成提供碳骨架； 为糖异生提供基本途径。,磷酸戊糖途径的生理意义 产生大量NADPH作为生物合成所需的还原力。 HMP途径中生成C3、C4、C5、C6、C7等各种长短不等的碳链，这些中间产物都可作为生物合成的前体。 在特殊情况下，

41、HMP也可为细胞提供能量。 HMP途径是戊糖代谢的主要途径，为核苷酸和核酸的生物合成提供戊糖-磷酸,一般认为HMP途径不是产能途径，而是为生物合成提供大量的还原力NADPH和中间代谢产物，如核酮糖-5-P是合成核酸、某些辅酶及组氨酸的原料；NADPH是合成脂肪酸、类固醇和谷氨酸的供氢体。另外，核酮糖-5-P还可以转化为核酮糖-1,5二磷酸，在羧化酶作用下固定CO2，对于光能自养菌，化能自养菌具有重要意义。虽然这条途径中产生的NADPH可经呼吸链氧化产能，1mol葡萄糖经HMP途径最终可得到35molATP，但这不是代谢的主要方式，不能把HMP途径看作产生ATP的有效机制。,ED途径是在研究嗜糖

42、假单胞菌 （Pseudomonas Saccharophila）时发现的，在ED途径中，葡萄糖-6-P首先脱氢产生葡萄糖酸-6-P，接着在脱水酶和醛缩酶的作用下，产生一分子甘油醛-3-P和一分子丙酮酸，然后甘油醛-3-P进入EMP途径转变成丙酮酸。一分子葡萄糖经ED途径最后生成两分子丙酮酸，一分子ATP，一分子NADPH和NADH。ED途径在G-菌中分布较广泛，特别是假单胞菌和固氮菌的某些菌株较多存在。ED途径可不依赖于EMP,HMP途径而单独存在，但对于靠底物水平磷酸化类的ATP的厌养菌而言，ED途径不如EMP途径经济。,一、 有氧呼吸 是以分子氧作为最终电子(或氢)受体的氧化过程；是最普遍

43、、最重要的生物氧化方式。 途径：EMP,TCA循环 特点：在有氧呼吸作用中，底物的氧化作用不与氧的还原作用直接偶联，而是底物在氧化过程中释放的电子先通过电子传递链（由各种电子传递体，如NAD,FAD,辅酶Q和各种细胞色素组成）最后才传递到氧。 由此可见， TCA循环与电子传递是有氧呼吸中两个主要的产能环节。,TCA中受还原型NADH或FADH抑制的酶，丙酮酸脱氢酶系， 柠檬酸合成酶（大）、a 酮戊二酸脱氢酶系，,下一个问题，产生还原力（ NADH或FADH ）的去向,交给中间产物（柠檬酸发酵等）,经呼吸链把氢和电子交给氧，产生ATP,不经呼吸链把氢和电子交给氧，能量已发光形式 放出（生物发光，

44、海生细菌和木腐菌）,交给外援电子受体产物（无氧呼吸）,2、呼吸链（电子传递链）,呼吸链又称电子传递链，是氧化磷酸化一个重要组成部分。 它是指从葡萄糖或其他氧化型化合物上脱下的氢(电子)，经过一系列按照氧化还原势由低到高顺序排列的氢(电子)传递体，定向有序的传递系统， 是由一系列氢和电子传递体组成的多酶氧化还原体系，,原核微生物的呼吸链在细胞膜上，真核微生物的呼吸链位于线粒体内膜，但呼吸链的主要组分是类似的,包括呼吸链主要成分有烟酰胺脱氢酶的辅酶NAD+或NADP+，黄素脱氢酶类的辅基FMN或FAD，泛醌或辅酶Q，铁硫蛋白类，细胞色素b、c1、c、aa3等,原核微生物呼吸链的特点,电子供体多样。

45、除了葡萄糖或其他有机基质外、分子氢、硫等无机元素，Fe2+、NH4+、 NO2-等无机离子也可用作电子供体； 电子受体多样。除了分子氧外，可用作最终电严受体的还有N03-、NO2、NO、SO42-、S2-、CO32-等，甚至延胡索酸、甘氨酸、二甲亚砜和氧化三甲亚胺等有机化合物 细胞色素种类多样。有各种类型细胞色素，如a、al、a2、a4、b、b1、c、c1、c4、c5、d以及o等； 电子传递链不完整。例如硝酸还原酶。 末端氧化酶多样，不仅有细胞色素a1、a 2、a3、d、o等，还有H2O2酶和过氧化物氧化酶等；,呼吸链组分和含量多变，细菌呼吸链的组分和含量随着氧气的供应、生长阶段、基本营养供应

46、、呼吸抑制剂的存在与否,CN、Fe2+、SO42-浓度等变化而改变； 细菌呼吸链有多条，且有分支。不仅有一般的呼吸链，还有分支的呼吸链。例如，大肠杆菌在缺氧条件下，呼吸链在CoQ(辅酶Q，泛醌)后分支，一支为Cytb559-CytO，另一支是Cytb558-Cytd。维捏兰德固氮菌：通过呼吸链Cytb1后的分支控制细胞内氧的分压。 电子传递方式多样化，在细菌中电子可经CoQ传递给细胞色素，也可不经CoQ而直接传递给细胞色素。 在细胞质膜上 效率低，通常小于1,电子传递磷酸化,在电子传递磷酸化中，通过呼吸链传递电子，将氧化过程中释放的能量和ADP的磷酸化偶联起来，形成ATP。 呼吸链中的电子传递

47、体主要由各种辅基和辅酶组成，最重要的电子传递体是泛琨（即辅酶Q）和细胞色素系统。在不同种类的微生物中细胞色素的成员是不同的。 产生ATP的效率比较低。,细菌呼吸链与线粒体呼吸链的区别,i细菌无线粒体，电子传递C膜上。 ii线粒体呼吸链目前只发现二条。即：NADH，FADH（琥珀酸）呼吸链，且都以Cyta3为末端色素氧化酶。 高等生物呼吸链： NADH2-FMN=CoQ-Cytb=Cytc1-Cytc-Cytaa3=O2 琥珀酸-FAD-CoQ-Cytb=Cytc1-Cytc-Cytaa3=O2 细菌呼吸链有多条，且有分支。末端氧化酸除a3外，还有a1,a2,a4,o等。,iii细菌电子传递链的

48、电子受体，供体可以多种多样。 iv 细菌电子传递链的组成，含量因细菌和培养条件的不同而不同,二、无氧呼吸 一类呼吸链末端的氢受体为外源无机氧化物 （个别为有机氧化物）的生物氧化，是一种无氧条件下进行的产能效率较低的特殊呼吸。 无氧呼吸的类型： 硝酸盐呼吸：NO3- NO2-, NO, N2 硫酸盐呼吸：SO42- SO32-,S3O62-,S2O32 无机盐呼吸 H2S 硫呼吸：S0 S-2 碳酸盐呼吸：CO2,HCO3- CH3COOH CO2, HCO3- CH4 延胡索酸呼吸：延胡索酸 琥珀酸,无氧呼吸：某些厌氧和兼性厌氧微生物在无氧条件下进行无氧呼吸。无氧呼吸的最终电子受体不是氧，而是

49、像NO3-、NO2-、SO42-、CO2等这类外源受体。 与发酵不同，无氧呼吸也需要细胞色素等电子传递体，并在能量分级释放过程中伴随有氧化磷酸化作用而生成ATP，也能产生较多的能量。但由于部分 能量在没有充分释放之前就随电子传递给了最终电子受体，故产生的能量比有氧呼吸少。 在无氧呼吸中，作为能源物质的呼吸基质一般是有机物，如葡萄糖、乙酸等，通过无氧呼吸也可被彻底氧化成CO2，并伴随有ATP的生成。,例如： 硝酸盐还原细菌在厌氧条件下，可把NO3-作为电子的最终受体，即:,根据微生物还原硝酸的去向分为同化型硝酸还原和异化型硝酸还原,硝酸盐呼吸(nitrate respiration)-也称反硝化

50、作用(denitrification)。硝酸盐在微生物生命活动中具有两种功能：NO3作为微生物的氮源营养物；在无氧时NO3作为呼吸链的最终氢受体。有些细菌能以NO3为最终氢受体，这些细菌称为反硝化细菌或硝酸盐还原菌。如地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)、脱氮副球菌(Paracoccus denitrification)及铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)等均能 进行反硝化作用 意义：对自然界氮素循环有重要意义，氮素在海洋中积累，反硝化作用分解之。 害处：造成土壤中氮素的损失，对农业生产不利。 能量：产能一般45个ATP，比发酵多比有氧呼吸少。

51、,硫酸盐呼吸（还原）,三、自养微生物的生物氧化,还原CO2时ATP和H的来源,顺呼吸链传递,CO2 NH4+, NO2-, H2S, S ATP,(最初能源) 耗H产ATP,逆呼吸链传递,S,H2,Fe2+ NAD(P)H2,（无机氢供体） 耗ATP产H,CH2O,（一）氨的氧化 NH3同亚硝酸（NO2-）可以做能源的最普通的无机氮化合物，能被硝化细菌氧化，硝化细菌可分为2个亚群：亚硝化细菌和硝化细菌。 氨氧化为硝酸的过程分为2个阶段，先由亚硝化细菌将氨氧化为亚硝酸，再由硝化细菌将亚硝酸氧化为硝酸。 硝化细菌都是一些专性好氧的革兰氏阳性细菌，以分子氧为最终电子受体，绝大多数是专性无机营养型。,

52、（二）硫的氧化 硫杆菌能利用一种或多种还原态或部分还原态的硫化物作能源。H2S首先氧化成元素硫，再被硫氧化酶和细胞色素系统氧化成亚硫酸盐，放出的电子在传递过程中偶联产生4个ATP。 亚硫酸盐的氧化分为两条途径：一是直接氧化成SO42-的途径，由亚硫酸盐-细胞色素C还原酶和末端细胞色素系统催化，产生1个ATP；二是经磷酸腺苷硫酸的氧化途径，每氧化1分子SO32-产生2.5个ATP。,（三）铁的氧化 从亚铁到高铁的氧化，对少数细菌而言是一种产能反应，但只有少数的能量可被利用。 在低PH环境中利用亚铁氧化时放出的能量生长，在电子传递到氧的过程中细胞质内有质子消耗，从而驱动ATP的合成。,（四） 氢的

53、氧化 氢细菌都是一些革兰氏阴性的兼性化能自养菌。能利用分子氢氧化产生的能量，同化CO2，也能利用其他有机物生长。氢细菌中，电子直接从氢传递给电子传递系统，电子在呼吸链传递过程中产生ATP。多数氢细菌中有两种与氢的氧化有关的酶（颗粒状氧化酶：驱动质子的跨膜运输，形成跨膜质子梯度，为ATP的合成提供动力；可溶性氢化酶：催化氢的氧化，使NAD+还原，所生成的NADH主要用于CO2的还原。）,四、能量转移 在产能代谢过程中，微生物通过底物水平磷酸化和氧化磷酸化将某种物质氧化释放的能量存于ATP等高能分子中，对光合微生物可通过光合磷酸化将光能转变为化学能存于ATP中。 ATP的生成方式,光合磷酸化 氧化

54、磷酸化,底物水平磷酸化 电子传递磷酸化,1、底物水平磷酸化：在发酵途径中，通过底物水平磷酸化合成 ATP ，是营养物质中释放的化学能转换成细胞可利用的自由能的主要方式。底物水平磷酸化是指物质在氧化过程中，常生成一些含有高能键的化合物，而这些化合物可直接偶联ATP或GTP的合成，这种产生ATP等高能分子的方式称为底物水平磷酸化。底物水平磷酸化既存在于发酵过程中，也存在于呼吸作用过程的某些步骤中。如在EMP途径中，1,3-二磷酸甘油酸转变为 3-磷酸甘油酸以及磷酸烯醇式丙酮酸转变为丙酮酸的过程中，均通过底物水平磷酸化分别产生1分子ATP。在三羧酸循环中，琥珀酰辅酶A转变为琥珀酸时通过底物水平磷酸化

55、生成1分子高能磷酸化合物GTP。,2、氧化磷酸化：物质在生物氧化过程中形成的NADH或FADH2可通过电子传递链将电子传递给氧或其他氧化型物质，在这个过程中伴随着将ADP磷酸化而形成ATP的过程，称为氧化磷酸化。,氧化磷酸化,物质在生物氧化过程中形成的NADH和FADH2可通过位于线粒体内膜和细菌质膜上的电子传递系统将电子传递给氧或其他氧化型物质，在这个过程中偶联着ATP的合成，这种产生ATP的方式叫氧化磷酸化。,ATP,ATP,ATP,光合磷酸化,光合作用的实质是通过光合磷酸化将光能转变为化学能，以用于从CO2合成细胞物质。除了绿色植物以外，能进行光合作用的微生物还有藻类、蓝细菌和光合细菌（

56、包括紫色细菌、绿色细菌、嗜盐细菌等）。 在光合磷酸化过程中，一个叶绿素（或细菌叶绿素）分子吸收光量子即被激活，导致叶绿素释放一个电子而被氧化，释放出的电子在电子传递系统中逐步释放能量。,光合磷酸化,环式光合磷酸化,非环式光合磷酸化,蓝细菌与高等植物,紫色硫细菌、绿色硫细菌、紫色非硫细菌和绿色非硫细菌,微生物次级代谢与调节,引论 微生物次级代谢的特征 次级代谢产物的类型 抗生素的生源学 初级与次级代谢途径相互连接 次级代谢物生物合成的前体 前体的概况 前体的作用 前体的限制性 次级代谢物生物合成原理 微生物次级代谢作用的调控,微生物次级代谢的特征,一般在菌的生长后期产生，往往以初级代谢产物为前体 。 生长期末细胞内酶的组成发生变化，与次级代谢物合成相关酶的突然出现有关； 也可能是前体的积累，诱导； 编码次级代谢产物的基因从分解代谢物阻遏中解脱所致。 种类繁多，含有不寻常的化学键：氨基糖、苯醌、环氧化合物、吲哚衍生物、四环类抗生素等。 一种菌可产生结构相近的一族抗生素： 产黄青霉能产生至少10个具有不同特性的青霉素，他们具有不同的生物活性。 次级代谢涉及的酶专一性较低。,一种微生物的不同菌株可以产生多种在分子结构上完全不同的次级代谢产物：灰色