RNA干扰技术 (1).ppt

1、,RNA 干 扰 技 术,提纲,第一部分 RNA干扰理论基础 一、RNA干扰概述 二、 RNA干扰的机理 第二部分 RNA干扰技术应用 一、小干扰RNA(siRNA)序列设计 二、 siRNA的合成 三、 siRNA的转染 第三部分 RNA干扰在中药学上的应用展望,一、RNA干扰概述,1、 RNA干扰定义 2、 RNA干扰简介 3、 RNA干扰研究简史,一些小的双链RNA(siRNA)可以通过促使特定基因的mRNA降解来高效、特异的阻断体内特定基因表达，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型，称为RNA干扰（RNAi）。,1、 RNA 干扰定义,2、 RNA干扰简介,RNAi的发现具有划时代的意义，

2、它不仅深入揭示了细胞内基因沉默的机制，而且它还是后基因组时代基因功能分析的有力工具，极大地促进了人类揭示生命奥秘的进程；此外， siRNA本身还是一种极具前景的基因靶向药物，可广泛地用于诸如癌症等疾病的治疗。鉴于siRNA技术的巨大意义与广阔应用前景，2002年美国科学杂志将其评为全球年度十大科学进展之首。,2006年的诺贝尔生理学奖获得者：,Andrew Z. Fire Craig C. Mello,3、RNAi 研 究 史,20多年前，在对矮牵牛花（petunias）进行的研究中发现协同抑制现象cosuppression，导入的基因和其相似的内源基因同时都被抑制。,1995年，康奈尔大学的

3、研究生Su Guo（郭苏）用 反义RNA阻断线虫基因表达的试验中发现，反义和正义RNA都阻断了基因的表达。结果出乎意料。；三年后，Fire等真正起作用的是微量双链RNA（污染），注入双链RNA到线虫中发现比注入单链更有效，随后发展了通过RNAi进行线虫基因敲除的策略。,在果蝇的研究中同样发现RNAi。通过显微注射或者通过基因枪将dsRNA注入果蝇胚胎中能够引发基因沉默。在过去的几年中RNAi技术在果蝇的研究中成为一种反向遗传工具，用于鉴定功能缺失表型。,2001年Elbashir等 Nature上首次报道通过21个核苷酸的siRNA成功地在哺乳动物培养细胞中诱导特异性基因沉默。随后，在小鼠等多

4、种细胞中也取得了成功。,牵牛花（petunias） 协同抑制现象cosuppression，,线虫的RNAi,（左）两线虫带有含普遍性表达的GFP报告基因重组质粒的 表达品系。 （右）喂食表达针对GFP的dsRNA的细菌后，整个虫体GFP 信号消失（头部区域有些神经元对该效应具有抗性)。,RNAi 机制 模式图,在起始步骤，加入的dsRNA被Dicer酶切割为21-23核苷酸长的小分子干扰RNA片段,在RNAi效应阶段，siRNA双链结合一个核酶复合物从而形成所谓RNA诱导沉默复合物（RNA-induced silencing complex, or RISC）,激活的RISC通过碱基配对定位

5、到同源mRNA转录本上,激活RISC需要一个ATP依赖的将siRNA解双链的过程,并在距离siRNA3端12个碱基的位置切割mRNA,Degradation of the target mRNA (引起靶标mRNA的降解), Inhibition of translation of the target mRNA (抑制靶标mRNA的翻译), Silencing the gene transcription from the target promoter (引起靶标启动子的转录沉默).,The targets of the RNAi-directed gene silencing （RNA干

6、扰指导的基因沉默的结果）：,第二部分 RNA干扰技术应用,一、小干扰RNA(siRNA)序列设计 二、 siRNA的合成 三、 siRNA的转染,确定目的基因 根据相对应的核酸序列设计出 siRNA的序列 获得siRNA 用siRNA转染细胞 分析RNA干扰的效果,RNA干扰研究的一般流程,一、小干扰RNA(siRNA)序列设计,1、 siRNA的一般结构 2、siRNA靶位点的选择,siRNA的一般结构： 哺乳动物：21-23bp dsRNA 非哺乳动物：长片段dsRNA,1、 siRNA的一般结构,如何选择siRNA靶位点：,2、siRNA靶位点的选择,2、研究结果显示GC含量在30%50

7、%左右的siRNA要 比那些GC含量偏高的更为有效。,1、从转录本AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列， 记录跟每个AA 3端相邻的19个核苷酸作为候选的 siRNA靶位点。,3、在设计siRNA时不要针对5和3端的非编码区（untranslated regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响RISC结合mRNA,从而影响siRNA的干扰效果。,序列同源性分析：,将siRNA序列和相应的基因组数据库（人，或者小 鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列 / EST同源的序列。例如进行BLAST搜索分析（ www.

8、/BLAST/）,选出合适的目标序列进行合成,并非所有符合条件的siRNA都一样有效，其原因还不清楚，可能是位置效应的结果，因此对于一个目的基因，一般要选择3-5个靶位点来设计siRNA,设计阴性对照,通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查 结果以保证它和其他基因没有同源性。或者用housekeeping genes 作对照.,补充：,Whitehead 研究所已研发了siRNA的自动选择方法，并于 网站：/bioc/siRNA/home.php 上向公 众开放这个软件允许使用者定义序列基序和G/C含量， 并

9、自动在人和鼠的基因组数据库中搜索siRNA序列，以 防错配。,疑难解答：,假如siRNA不起作用，应首先确定所使用的靶序列和细胞是 否来源于相同的组织。是否使用了错误的细胞系。 应确定用于进行RNAi的siRNA双链对选择的mRNA序列是否 可靠的，因后者可能包含序列上的错误、突变（如在癌细胞 中）或存在多态性。,二、 siRNA的合成,1、化学合成 2、体外转录 3、用RNase 消化长片断双链RNA制备siRNA 4、体内表达,1、化学合成,许多公司可以根据用户要求提供高质量的化学合成siRNA。主要的缺点包括价格高，定制周期长，特别是有特殊需求的。由于价格比其他方法高，为一个基因合成34

10、对siRNAs 的成本就更高了，比较常见的做法是用其他方法筛选出最有效的序列再进行化学合成。 最适用于：已经找到最有效的siRNA的情况下，需要大量siRNA进行研究 不适用于：筛选siRNA等长时间的研究，主要原因是价格因素,双链 RNA合成 非特异siRNA合成,2、体外转录,3、非特异性siRNA合成,大肠杆菌RNase III是一种识别双链 RNA的内切酶，产物为 3端外悬2-3个碱基的双链短片段，与 Dicer在真核生物RNAi途径中相同。利用RNase III 消化得到的siRNA混合物直接转染细胞，通常能够保证目的基因被有效地抑制。,用RNase III 消化长片断双链RNA制备

11、siRNA,Figure 2: siRNA production by ShortCut RNase III: (A) Varying amounts of ShortCut RNase III were incubated with 2 g of a 500 bp dsRNA for 20 minutes. (B)dsRNA fragments (1 kb and 175 bp) were digested with ShortCut RNase III. Digestswere analyzed by 20% TBE polyacrylamide gel electrophoresis.,

12、Figure 3: GFP Silencing in COS-7 Cells: COS-7 cells co-transfected with a plasmid expressing GFP in the absence (control) or the presence of 30ng (4 nM) of GFP siRNA prepared using the ShortCut RNAi Kit. Cells were photographed 48hours post-transfection.,siRNA表达载体在细胞中表达siRNAs 以PCR制备的siRNA表达框进行体内转录 利

13、用病毒系统实现体内表达siRNA,4、体内转录合成 siRNA,优点：不需要直接操作RNA,siRNA表达载体,BD Knockout RNAi vectors,siRNA表达框架(siRNA expresion casetes，SECs)是一种由PCR得到的siRNA表达模板，能够直接导入细胞进行表达而无需事前克隆到载体中。,siRNA表达框进行体内转录,表达框架包括：,一个RNA pol III启动子,一段发夹结构siRNA,一个RNA pol III终止位点,优点：SECs不需要载体克隆、测序等颇为费时的步骤，可以直接由PCR得到。SECs成为筛选siRNA最有效工具。,缺点：PCR产物

14、难以转染入细胞、不适合大规模制备。,SiRNA 的 转 染,RNAiFect Transfection Reagent siRNA 转染专用试剂，使用简单。,转染方法： 1 磷酸钙共沉淀; 2 电穿孔法; 3 DEAE-葡聚糖 4 机械法 5 阳离子脂质体试剂,注意事项： 1 纯化 siRNA ； 2 避免RNA酶污染 3 细胞培养和操作严格 4 避免使用抗菌素 5 选择合适的转染试剂 6 合适的阳性对照 7 通过标记siRNA来优化实验,第三部分、RNAi技术在中药学上的的应用,一、 RNAi在证候-基因组研究中的应用 二、 RNAi在中药生产中的应用,老子说:“万物负阴而抱阳”；易经说：“

15、一阴一阳谓之道”。,有过多的mRNA,siRNA就会与之结合,进而把它降解来完成机体的自稳(阴阳的对立制约), mRNA的降解进而又转换成siRNAs以继续执行功能(阴阳的相互转化),siRNAs和mRNA互根互用、消长平衡来完成机体的自稳及清除外来的病原体。,siRNA（阴）,mRNA（阳）,一、RNAi在证候-基因组研究中的应用,证候研究是中医科学研究的重点和难点,也是制约中医发展的颈瓶。人类基因组学研究的方法学内容与中医学的整体观、辨证观有许多相似之处。在微观水平的基因调控与修饰,反映着生命机体的整体功能状态,基因组的多样性高度强调了每个人的基因特异性。因此如何揭示证的本质,如何把证候和

16、现代科学联系起来是值得中医研究者去思考的。,一、RNAi在证候-基因组研究中的应用 广州中医药大学脾胃研究所通过基因芯片研究,筛选出了脾气虚证核糖体蛋白下调基因RPS20、RPS29、RPL35、RPL27;同时也进行了脾气虚证异病同证差异基因研究,通过收集溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)脾气虚证及湿热证患者结肠病变黏膜,制作核糖体蛋白的低密度芯片,筛选出多条下调基因。证候基因组学的深入发展必然要求对这些基因的功能进行综合评价,寻找其中的关键基因,并明确差异基因相互作用的关系,对证候本质进行深入研究。,一、RNAi在证候-基因组研究中的应用 因此,在此基础上,该所采用RNAi技术在IEC-6细胞上对脾虚证关键基因RPS20的功能进行了鉴定。结果提示,干扰IEC-6细胞RPS20后,细胞形态结构发生改变,细胞迁移、增殖能力受到抑制,表明小肠上皮细胞可能存在着消化吸收功能低下及黏膜修复减慢趋势。此结果说明了RPS20可能在脾虚证发生发展中起到了重要的作用。,RNA 干扰是一种新型反义技术, 即把dsRNA 导入细胞引起同源mRNA 降解， 可抑制特异基因的表达, 对药用植物次生代谢产物的生物合成途径进行调控, 达到调控天然产物生物合成的目的. 张荫麒利用反义DNA或RNA 片段导入亚麻植物毛状根中抑制肉桂醇脱氢酶活性,