碱性磷酸酶米氏常数的测定-3学时

1、碱性磷酸酶米氏常数的测定,浙江中医药大学生命科学学院 生物化学教研室,目的与要求 通过碱性磷酸酶米氏常数的测定，了解其测定原理、方法及意义。,原理,酶催化底物发生反应时，受多种因素影响，环境的温度、pH和酶的浓度等等，在环境的温度、pH和酶的浓度一定时，酶促反应速度与底物浓度之间的关系如下图。酶促反应的速度(V)随底物浓度(S)的增加而迅速增加。若继续增加底物浓度，反应速度的增加率将减少。当底物浓度增加到某种程度时，反应速度会达到一个极限值，即最大反应速度(Vmax)，,底物浓度与酶促反应速度的这种关系可用Michaelis-Menten方程式表示。 V = VmaxS/(Km+S) 上式中V

2、max为最大反应速度，S为底物浓度，Km为米氏常数(Michaelis constant)，而其中V则表示反应的起始速度。当V= Vmax/2时，Km =S。所以米氏常数是反应速度等于最大反应速度一半时底物的浓度。因此Km的单位以摩尔浓度(molL)表示。 Km是酶的最重要的特征性常数，测定Km值是研究酶动力学的一种重要方法，大多数酶的Km值在0.01-100(mmol/L)间。 酶促反应的最大速度Vmax实际上不易准确测定，Km值也就不易准确测出。林-贝 (Lineweaver - Burk)根据Michaelis-Menten方程，推导出如下方程式，即： 1/V = （Km +S）/ Vm

3、axS或1/V = Km/ Vmax（1/S）+1/ Vmax,此式为直线方程，以不同的底物浓度1/S为横坐标，以1/V为纵坐标，并将各点连成一直线，向纵轴方向延长，此线与横轴相交的负截距为-1/ Km，由此可以正确求得该酶的Km值，如图所示。,本实验以碱性磷酸酶为例，测定不同底物浓度的反应速度，再根据Lineweaver-Burk法作图，计算其Km值。 可以作为碱性磷酸酶底物的物质很多，底物反应的酶对于不同的底物有不同的Km值。本实验以磷酸苯二钠为底物，由碱性磷酸酶催化水解，生成游离酚和磷酸盐。酚在碱性条件下与4-氨基安替比林作用，经铁氰化钾氧化，生成红色的醌衍生物，颜色深浅和酚的含量成正比

4、。吸光度的大小可以表示反应速度的大小。反应式如下：,三、试剂与器材 10.04mol/L 基质液 20.1molL碳酸盐缓冲液pH10(37) 3碱性溶液 40.5铁氰化钾 50.3 4-氨基安替比林 637恒温水浴锅 7可见光分光光度计,四、操作步骤 1. 底物浓度对酶促反应速度的影响 (2)加入血清后，各管混匀并且立即记录时间，将上述各管置37水浴中准确保温15分钟。 (3)保温结束，立即加碱性溶液1.1mL终止反应。,(4)各管分别加入0.3 4-氨基安替比林1.0mL，0.5 铁氰化钾2.0mL，充分混匀，放置10分钟，以6号空白管作对照，于510nm波长处比色测定。 (5)以各管基质

5、浓度的倒数1/S为横坐标，以各管吸光度的倒数作为1/V作纵坐标，作图求出Km值。 结果与计算 1.记录各管吸光度（A） 2.列表：吸光度、1/A、1/S 3.作双倒数图，由图得出Km值。,（一） Km值测定的意义,1.当反应速度为最大速度一半时，Vm = 1/2 Vmax，Km = S Km是指底物的浓度，含义：Km值等于酶促反应速度为最大速度一半时的底物浓度。 2. Km值可表示酶对底物的亲和力。 Km值愈小，酶与底物的亲和力愈大；表示不需要很高的 底物浓度便可容易地达到最大反应速度。 3.Km值是酶的特征性常数之一，只与酶的结构、酶所催化的底物和反应环境相关，与酶的浓度无关。 各种酶的Km值范围很广。大多