高效液相色谱法(全).ppt

1、1,第20章 高效液相色谱法,2,第20章 高效液相色谱法,1 概述 2 高效液相色谱仪 3 高效液相色谱固定相和流动相 4 四种类型的色谱简介 5 HPLC方法的建立和应用,3,1 概述,一、高效液相色谱法的产生和发展 二、高效液相色谱法的特点 三、高效液相色谱法的分类 四、正相色谱与反相色谱 五、基本原理,4,一、高效液相色谱法的产生和发展,薄壳型填料，柱效仅每米10003000塔板数,510m球型和无定型微粒硅胶，每米56万理论塔板数,新型分离模式和方法不断增加,高度均匀甚至单分散13m硅胶基质球形填料，达1530万理论塔板/m。,5,一、高效液相色谱法的产生和发展,液相色谱 (LC)

2、：以溶剂液体为流动相 的色谱方法 高效液相色谱（HPLC）： 高效能固体细微粒为固定相 高压溶剂为流动相 高灵敏度检测器,6,二、高效液相色谱法的特点,1. 特点 高速、高效、高选择性、高灵敏度 传质速率低，柱效高 适用范围广 流动相选择范围宽,7,2. 局限性,设备复杂 使用多种溶剂作流动相，成本高，易引起环境污染 缺少气相色谱中使用的通用型检测器,8,3. HPLC与经典LC的比较,9,4. HPLC与GC的比较,10,三、高效液相色谱法的分类,按固定相分类： 液-固色谱法 液-液色谱法,11,三、高效液相色谱法的分类,按分离机制分类： 分配色谱法 吸附色谱法 离子交换色谱法 体积排阻色谱

3、法（凝胶色谱）,12,四、正相色谱与反相色谱,反相色谱和正相色谱主要区别是流动相和固定相的相对极性 正相色谱：固定相极性 流动相相对非极性 极性最小的组分最先洗出 反相色谱：固定相非极性 流动相相对极性 极性最强的组分最先洗出,13,五、基本原理,高效液相色谱法的分离原理与经典液相色谱法一致。 塔板理论、速率理论、柱效、保留值、分配系数等概念和理论都可用于高效液相色谱法。 气体和液体在黏度、扩散系数、密度等方面存在明显差别。,14,1. 柱效的影响因素,固定相颗粒直径 固定相颗粒直径越小，板高越小，理论塔板数越大，柱效越高； 流动相黏度 降低流动相黏度，可提高样品分子在流动相中的扩散系数而降低

4、板高；,15,2. 分离度的影响因素,容量因子k：通过控制溶剂极性大小来调节； 提高理论塔板数n，降低塔板高度H： 选择因子：通过改变流动相的组成、pH值等来改变选择性；,16,17,2 高效液相色谱仪,18,2 高效液相色谱仪,高压输液系统：储液罐、吸滤器、高压 输液泵、脱气装置及梯度洗脱装置 进样系统：进样器，进样阀 分离系统：色谱柱，恒温箱 检测系统：检测器 记录系统：记录装置、色谱工作站,19,淋洗方式,等度淋洗 梯度淋洗：分离极性相差较大的混合物 流动相组成的变化是分段式的或连续式的，根据控制方式而定。 梯度洗脱优点：缩短分析时间；提高分离效能；改善峰形，减少拖尾；提高灵敏度。,20

5、,高压输液泵的要求,流量准确可调、可调范围宽：流动相流速在0.5-2mL/min，输液泵的最大流量5-10mL/min 耐高压：输出压力常达30-60MPa 液流稳定 结构材料应耐化学腐蚀,21,进样系统,高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约530cm），柱外展宽较突出。 柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。 进样系统是引起柱外展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。,22,进样系统,将样品溶液准确送入色谱柱的装置 手动方式、自动方式 进样器要求： 密封性好、死体积小、重复性好、进样时引起色谱系统的压力和流量波动要很小。 常

6、用手动进样器六通阀进样器,23,高效液相色谱柱,色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管常用金属材料制成。 一般色谱柱长530cm，内径为45mm，凝胶色谱柱内径312mm，制备柱内径较大，可达25mm 以上。 一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离性能不受影响。,24,高效液相色谱柱,1.色谱柱类型 按内径大小可大致分为常规分析柱、制备或半制备柱、小内径或微径柱、毛细管柱四种类型。 2.保护柱 一般在分析柱前装上较短的保护柱，不仅可除去溶剂中的颗粒杂质和污染

7、物，而且可除去样品中含有与固定相不可逆结合的组分，以保护较昂贵的分析柱，延长使用寿命。,25,高效液相色谱柱,3. 柱恒温器 对色谱柱严格控制温度可获得重现性更高保留值和更好分离色谱图。 4. 柱填充技术 根据填料粒径大小采用干法或湿法装柱。粒径大于20m，采用类似气相色谱的干法装柱，实际上这种方法己很少使用。 目前大多数采用10m以下填料，以称为等密度匀浆湿法装柱。,26,检测器,溶质性质检测器： 紫外吸收检测器 仅对被分离组分 荧光检测器 理化性质响应 总体检测器： 示差折光检测器 对试样和流动相 电导检测器 总理化性质响应,27,紫外检测器,检测原理：检测样品组分通过流通池时对特定波长紫

8、外线的吸收，引起透过光强的变化，而获得浓度-时间曲线。浓度与吸光度的关系服从Lambert-Beer定律。 特点：灵敏度高、噪声低；不破坏样品，能与其他检测器串联；对温度和流动相流速波动不敏感，可用于梯度淋洗。,28,紫外检测器,局限性：只能检测有紫外吸收的样品；流动相的选择有一定限制，对紫外吸收较大的溶剂如苯不能作为流动相使用。 应用：主要用于检测具有共轭结构的化合物，如芳烃、稠环芳烃、芳香基取代物、芳香氨基酸、核酸、羧基化合物等。,29,荧光检测器,具有流通池的荧光分光光度计 特点：选择性高，灵敏度高，检出限低，常用于梯度淋洗。 局限性：只能检测能够产生荧光或其衍生物能发荧光的物质。 应用

9、：主要用于检测氨基酸、多环芳烃、维生素、酶类等，是体内药物分析的常用检测器。,30,光电二极管阵列检测器,可获得组分的三维图谱，以获得更多信息。,31,示差折光检测器,属于通用型检测器，应用较多 缺点：对温度变化非常敏感，且不适于梯度淋洗。,32,3 高效液相色谱固定相和流动相,一、固定相要求： 粒径小、颗粒分布均匀 传质快、渗透压小 机械强度高、能耐高压 化学稳定性好,33,3 高效液相色谱固定相和流动相,二、流动相要求： 化学惰性 适宜的物理性质 溶剂清洗和更换方便，毒性小、纯度高、 价廉等，便于操作和安全 高纯度，化学稳定性好,34,四种类型液相色谱法的比较,35,一、吸附色谱,1.固定

10、相：吸附活性强弱不等的吸附剂 硅胶、氧化铝、聚酸胶等 2.流动相：各种极性的洗脱剂 3.分离原理：物质在固定相上的吸附作用不同 4.用途：非极性溶剂中、具有中等相对分子质量且为非离子型的试样。特别适用于分离异构体。,36,二、分配色谱,1.液-液分配色谱 （1）固定相 强极性固定液：，-氧二丙腈 中等极性固定液：聚乙二醇 非极性固定液：聚烯烃烷 （2）流动相 要求：流动相不与固定相互溶，流动相与固定相极性差别显著避免固定液流失,37,二、分配色谱,（3）分离原理 根据物质在两种互不相溶的液体中溶解度的不同，具有不同的分配系数。 （4）用途 适于各种极性化合物的分离 （5）缺点 固定液机械涂渍、

11、固定液易流失,38,二、分配色谱,2.化学键合相色谱 应用最广的是反相键合相色谱,39,二、分配色谱,3.离子对色谱 （1）原理：将与待测物离子A电荷相反的离子B加入到流动相中形成离子对AB，间接改变待测离子保留特性 （2）用途：主要用来分离强极性有机酸和有机碱,40,二、分配色谱,4.手性色谱 用来分离手性化合物,41,二、分配色谱,5.亲和色谱 （1）固定相：生物专一性配基+载体 （2）流动相：一定pH的缓冲液 （3）原理：利用生物大分子和固定相表面存在生化特异性亲和力，进行选择性分离 （4）用途：蛋白、酶、抗体分离，生物和医药分析,42,三、离子交换色谱,1.固定相： 基质：合成树脂（聚

12、苯乙烯）、纤维素和硅胶 表面键合离子：阳离子和阴离子交换树脂 2.流动相：一定pH和盐浓度的缓冲溶液 3.原理：不同待测离子对固定相亲和力的差别 4.用途：适用无机离子、有机离子混合物的分离。例如氨基酸、核酸、蛋白质等生物大分子。,43,四、体积排阻色谱,1.固定相： 化学惰性的多孔性材料，如聚苯乙烯凝胶、亲水凝胶、无机多孔材料。 2.流动相： 作用不是为了控制分离，而是为了溶解样品或减小流动相粘度。 常用流动相：四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水 3.原理：利用被测组分分子大小不同、在固定相上选择性渗透实现分离。,44,四、体积排阻色谱,4.特点 固定相与分子间作用力趋于零，柱寿命长 相对

13、分子质量差别必须大于10才能分离 5.用途 凝胶过滤色谱： 以水或缓冲液作流动相 主要适合于水溶性高分子的分离 凝胶渗透色谱： 以有机溶剂作流动相 主要适合于脂溶性高分子的分离,45,5 HPLC方法的建立和应用,一、建立HPLC分析方法的一般步骤 1、根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种HPLC分离方式。 材料来源、浓度范围 组分特性、结构、分子量、溶解性等,46,一、建立HPLC分析方法的一般步骤,2、选择合适的分析方法 适用的色谱柱：柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径） 流动相 检测器 样品预处理,47,一、建立HPLC分析方法的一般步骤,3.分析条件的优化 流动相种类与配比 梯度 温度 流速 检测波长 进样量 4、由获得的色谱图进行定性分析和定量分析,48,二、 HPLC的应用,1、在食品分析中的应用 食品营养成分分析：蛋白质、氨基酸、糖类、色素、维生素、香料、矿物质等； 食品添加剂分析：甜味剂、防腐剂、着色剂、抗氧化剂等； 食品污染物分析：霉菌毒素、微量元素、多环芳烃等。 2、在环境分析中的应用 多环芳烃、农药（如氨基甲酸脂类）残留等。,49,二、 HPLC的应用,3、在生命科学中的应用 分子水平上研究生命科学、遗传工