第15章 核酸的物理化学性质.ppt

1、第15章 核酸物理化学性质,Nucleic Acid,一、核酸的水解,核酸可被水解的位点有磷酸酯键和糖苷键，其中糖苷键更易被水解。,核酸的酸水解,嘌呤碱的糖苷键比嘧啶碱的糖苷键对酸更不稳定，对酸最不稳定的是嘌呤与脱氧核糖之间的糖苷键。DNA在pH1.6于37对水透析可完全除去嘌呤碱；在pH2.8于100加热1h，也可完全除去嘌呤碱。,核酸的碱水解,RNA的磷酸酯键易被碱水解，产生核苷酸。 DNA的磷酸酯键则不易被碱水解。这是因为RNA的核糖上有2OH，在碱作用下形成磷酸三酯。磷酸三酯极不稳定，随即水解，产生核苷2，3环磷酸酯。该环磷酸酯继续水解产生2核苷酸和3核苷酸。 DNA一般对碱稳定，若在

2、1mol/L NaOH中加热至100 4h，可以得到小分子的寡聚脱氧核苷酸。,核酸的酶水解,水解核酸的酶种类很多。非特异性水解磷酸二酯键的酶为磷酸二酯酶，如蛇毒磷酸二酯酶和牛脾磷酸二酯酶。专一水解核酸的磷酸二酯酶称为核酸酶。另外还有非特异水解糖苷键的糖苷酶。,核酸酶的分类,按底物专一性分类：作用于RNA的称为RNA酶（ribonuclease，RNase）；作用于DNA的称为DNA酶（deoxyribonuclease，DNase）。 按对底物作用的方式可分为核酸内切酶（endonuclease）和核酸外切酶（exonuclease）。少数核酸酶既可内切又可外切。,核酸酶的分类,核酸外切酶有5

3、3方向切割的，也有35方向切割的，分别称为53外切酶和35外切酶。还有对特定核苷酸序列部位进行切割的。如:限制性核酸内切酶,二、核酸的酸碱性质,具有芳香环结构特点 能发生酮式/烯醇式、氨式/亚氨式互变 嘌呤和嘧啶碱基都具有弱碱性 _主要是环内氨基的贡献,1、碱基的解离,胞嘧啶中 尿嘧啶及胸腺嘧啶中,鸟嘌呤和次黄嘌呤中质子则结合到N7上,2、核苷的解离 戊糖可增强碱基的酸性解离 核糖中的羟基也可发生解离 3.核苷酸的解离 磷酸基使核苷酸具有很强的酸性,DNA等电点为44.5； RNA等电点为22.5,三、核酸的紫外吸收,碱基含有共轭双键 最大吸收峰260nm左右,核酸溶液紫外吸收以摩尔磷的吸光度

4、表示，摩尔磷即相当于摩尔核苷酸。,：摩尔吸光系数 A：吸收值 W：每升溶液磷重量 L ：比色杯内径,OD260的应用： 1. DNA或RNA的定量 OD260=1.0相当于 50g/ml双链DNA 40g/ml单链DNA（或RNA） 20g/ml寡核苷酸 2.判断核酸样品的纯度 DNA纯品: OD260/OD280 = 1.8 RNA纯品: OD260/OD280 = 2.0 含杂蛋白及苯酚，降低 3.判断DNA是否变性,四、核酸的变性、复性与杂交,(一) 核酸的变性（denaturation） 1、DNA的变性： 在某些理化因素作用下，DNA双链解开成两条单链的过程。,某些理化因素破坏了氢键

5、和碱基堆积力， 使核酸分子高级结构改变、理化性质及 生物活性发生改变。 不涉及磷酸二酯键断裂，一级结构不变,2、变性的实质,降解：核苷酸骨架上3，5 -磷酸二酯键的断裂,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,高温（一般75） 热变性 强酸、碱 酸碱变性 甲醛（Agarose中RNA ） 尿素（PAGE中DNA ）,3、变性因素,OD260增高 粘度下降 比旋度下降 浮力密度升高 酸碱滴定曲线改变生物活性丧失,4、变性后理化性质变化,RNA变性：从螺旋到线团之间的转变 RNA的变性引起的性质变化没有DNA明显,完全变性后核酸紫外吸收值增加： 天然DNA 2540%、RNA 约1.1% 实质：碱基暴

6、露,由于变性或降解引起紫外吸收增加的现象称增色效应,DNA变性,5、DNA热变性的特征,变性过程是“跃变式”的，而非渐变,解链曲线：连续加热DNA，以温度对A260作图，所得的曲线称为解链曲线。,指增色效应达50%时的温度 一般DNA Tm 值在85 - 90 C之间,Tm：DNA变性时，OD260达到最大值的50%时的温度称为DNA的解链温度或融解温度(Tm)。 大小与G+C含量成正比。,（1）DNA的均一性： （2）GC含量： 经验公式： XG+C（Tm69.3）2.44 （3）介质中的离子强度：,Tm值大小与下列因素有关：,(二)核酸的复性（renaturation）,变性DNA在适当的条件下，两条彼此分开的单链重新缔合成双链复性。,热变性的DNA经缓慢冷却后即可复性，这一过程称为退火(annealing) 。,DNA复性,分子量越大复性越难； 浓度越大，复性越容易； DNA复性也与它本身组成和结构有关 （具有很多重复序列DN