B_01 苯酚生物降解菌的筛选

1、Central Laboratory of Biology,苯酚生物降解菌的筛选,目的要求,1. 掌握微生物分离纯化的基本操作； 2. 掌握用选择性培养基从土壤中分离苯酚生物降解菌的原理和方法。,基本原理,苯酚是一种在自然条件下难降解的有机物，其长期残留于空气、水体、土壤中，会造成严重的环境污染，对人体、动物有较高毒性。因此采用一定的方式降解苯酚，对保护人类健康、消除环境污染意义重大。在提倡绿色环保的大前提下，采用生物降解的途径势在必行。 微生物对污染物质的代谢、转化及降解作用，是当今环境污染研究中最活跃的领域之一。自然界中能降解烃类的微生物有几百种，多为细菌、酵母菌和真菌，降解是由他们所产生

2、的酶和酶系统完成的，一般直链化合物比支链化合物、饱和化合物比非饱和化合物、脂肪烃比芳香烃容易被较多种类的微生物降解和同化。直链烃的降解是末端甲基被氧化形成醇、醛后再生成脂肪酸，由脂肪酸形成醋酸，最后氧化成二氧化碳和水，微生物对单环芳烃及其衍生物的降解与直链烃类似，能降解苯和酚的微生物种类很多，细菌中的很多属，放线菌等。,基本原理,苯酚是芳香烃化合物。苯酚是常用的表面消毒剂之一，它们是TCA（三羧酸）循环的抑制剂。现已发现某些假单胞菌、争论产碱菌、真养产碱菌含有芳香烃的降解质粒，将其降解生成琥珀酸、草酰乙酸、乙酰CoA，进入TCA循环。 在苯酚浓度梯度培养基平板高含药区上分离出的菌落，对苯酚具有

3、较好的耐受性，可能具有分解酚菌的能力；然后将其在以苯酚为唯一碳源的培养基里进行摇床培养，淘汰掉不能利用苯酚的菌株，可筛选到苯酚降解菌；再用不同浓度的苯酚药物培养基分离，可筛选出耐受能力好，降解程度高的苯酚降解菌。,实验用品,1材料：（样品）实验土样采自校园肥沃土。 2器材和仪器：试管、250ml三角烧瓶、1 mL吸管、吸耳球、无菌涂棒、量筒、天平、灭菌锅、培养箱、酒精灯、接种环、棉花、棉线、牛皮纸。 3试剂：牛肉膏 蛋白胨 苯酚 K2HPO4 KH2PO4 MgSO4 FeSO4 琼脂 4. 培养基,2. 以苯酚为单碳源的菌株的筛选,1）单碳源培养基配制：按培养基D的配方，用250mL三角瓶，

4、每瓶装50mL，制成以苯酚为单碳源的液体摇瓶； 2）苯酚的浓度设定：苯酚的浓度分别按0.2g/L，0.4g/L，0.6g/L，0.8g/L，1.0g/L，1.2g/L六个浓度梯度配制； 3）平行样：每菌株、每药物浓度各配置平行样两瓶； 4）灭菌：121，20min； 5）接种：将初选的苯酚耐受性菌株，分别用少许无菌水稀释，接种于对应摇瓶中； 6）培养：八层纱布盖口，回旋式摇床，30，100转/min培养2天； 7）检测：用分光光度计测定OD值，以空白培养基作对照，检测各摇瓶菌体浓度； 8）筛选：淘汰掉不能利用苯酚为碳源的菌株。菌体浓度高的为生长较好者，即能以苯酚为单碳源的菌株，可进行下一步实验

5、。,3. 高耐受性苯酚降解菌的筛选,1）药物培养基平板的配制：按不同浓度（0.2 g/L ，0.4 g/L ，0.6 g/L ，0.8 g/L ，1.0 g/L ，1.2 g/L）苯酚配置药物培养基平板； 2）灭菌、倒平板：121，灭菌20min，倒平板，各菌株、各浓度配置两个； 3）菌悬液制备：将初选的培养液作适度稀释，或将保藏的经单碳源实验的菌株用无菌水制成菌悬液； 4）涂平板：用1mL移液管分别从各菌悬液试管中取菌悬液0.2mL涂布于药物培养基平板上，每一试管菌悬液涂布一组不同浓度的苯酚药物培养基平板，每一浓度设平板两个，六组共计12个； 5）培养：恒温培养箱30培养1-2天； 6）筛选：观察、记录并挑选高浓度药物培养基平板上生长旺盛的菌落，此即高耐受性苯酚降解菌，接种于牛肉膏蛋白胨培养基斜面； 7）保藏：编号，4冰箱保藏。,实验结果,1苯酚耐受菌株的初选结果,实验结果,2. 以苯酚为单碳源的菌株的筛选结果（生长情况OD值）,3. 高耐受性苯酚降解菌的筛选结果（菌落数）,实验结果,注意事项,1. 各种培养基的配制应严格按配方的要求完成，尤其是苯酚的称量和pH； 2. 涂布梯度平板的菌悬液只作适度稀释，菌浓度不必过低； 3. 涂布平板的菌悬液不要过多或过少，0.2mL为宜； 4. 梯度平板上挑取菌落时，要挑取单菌落；