《分子克隆工具酶》PPT课件.ppt

1、基因工程,田长恩 Tel:基因工程,1 基因工程概论,2 天然DNA的制备,3 分子克隆工具酶,4 分子克隆载体,5 表达载体,6 PCR技术及其应用,7 基因文库的构建,8 基因克隆的筛选策略,10 细菌基因工程,11 酵母基因工程,12 植物基因工程,13动物基因工程,14 基因工程的安全,9 转基因及其表达,3 分子克隆工具酶 3.1 限制性核酸内切酶与DNA切割 概念： （restriction endonuclease）一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶(endo-deoxyribonuclease)。 生

2、物学意义：是生物细胞内限制性修饰系统的一部分，可防止外源DNA的入侵（图）。生物在长期的演化过程中，含某种限制性核酸内切酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制性核酸内切酶的识别序列，或者通过甲基化酶把甲基转移到识别序列的碱基上，保护相应序列不被酶切割。 分布：细菌、少数霉菌和蓝藻中也有。 类型：即I、II和III型酶，各具特性(表)。分子生物学和基因工程操作中用的是II型酶。,Phage injects DNA into E. coli,RE binds to phage DNA,Phage DNA is cleaved,RE cannot binds to recognition seq

3、uence,Recognition sequence are methylated,E. coli DNA,The restriction and modification system in E. coli,命名：以酶的来源生物的属名和种名的第1、2个字母以及菌株（型）的代号来命名。如果从同一生物中先后提取到多种限制性核酸内切酶，则依次用罗马数字表示。例如，从 Haemophilus influenzae Rd中提取到的第三种限制性核酸内切酶被命名为Hind III。 作用机制：以环状和线形的双链DNA为底物，在合适的反应条件下，识别特定的核苷酸序列，使两条核糖核苷酸链上特定位置的磷酸二酯键

4、断开，产生具有3-OH基团和5-P基团的片段(图)。,黏性 (突出)末端的产生,内切酶造成DNA分子的断裂类型 （i）黏性（突出）末端: 两链的断裂位置交错、对称地绕着一个对称轴排列所形成的断裂。,（ii）平末端：两条链上的断裂位置处在一个对称结构的中心所形式的断裂。,II型限制性核酸内切酶的基本特性 与I及III型限制酶不同，II型酶只有一种多肽，并常以同源二聚体存在，具三个基本特性：（i）在DNA双链的特异识别序列切割DNA，产生断裂；（ii）通常2个单链断裂部位在DNA分子上不直接相对；（iii）因此，断裂形成的片段往往具有互补的单链延伸末端。 识别序列：能识别的核酸链上特殊的核苷酸序列

5、。绝大多数的II型酶的识别序列由48个特定的核苷酸组成，其中以6个为多。II型酶从识别序列内切割DNA，识别序列多连续 (如GATC），少间断（如GANTC），其共同特点是，双重旋转对称的结构形式，即回文结构(图).,切割位点就旋转对称轴而言位于对称的位置。产生黏性末端有两类：3-OH; 5-P。,3-OH 5-P,DNA的识别序列数：在随机排列的DNA中，由n个核苷酸组成的内切酶识别序列出现一次的概率为4n。 有的限制酶识别序列包含在另一种限制酶识别之内(如Sau3AI ：GATC； BamHI： GGATCC) 。 识别序列的多样化：一些限制酶能识别多种核苷酸序列，如HindII。,同裂酶

6、：识别序列相同而来源不同的酶(isoschizomer)。,同裂酶的用途：有些同裂酶对碱基甲基化的敏感性不同，可用来研究DNA甲基化作用。例如， HpaII和MspI的靶子是CCGG。当靶序列中有5-甲基胞嘧啶（C *C G G，*：甲基化碱基）时，HpaII不能切割，而MspI能切割。 同尾酶：来源和识别序列各不相同，但产生出相同粘性末端的酶（isocaudamer）。如BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII，产生粘性末端GATC。 同尾酶用途：同尾酶产生的粘性末端，能够通过之间的互补作用而彼此连接。 由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点，特称之为“杂种位点”

7、（hybrid site），一般不能再被原来的任何一种酶所识别，不过亦有例外（表）。,U：Pu，嘌呤；Y：Py，嘧啶,影响限制性核酸内切酶活性的因子 DNA的纯度：消化速率取决于DNA的纯度。DNA制剂的污染物有蛋白、酚、氯仿、酒精、EDTA、SDS、以及盐离子等，都可能抑制制酶活。 解决途径 增加酶量，每微克DNA可高达10单位或以上。 扩大反应体积，以稀释抑制因素。 延长反应时间。 提高纯度。 加入聚阳离子亚精胺(终浓度为 12.5 mmol/L) 。,DNA的分子结构: 构型影响酶活，某些酶切割超螺旋的质粒或病毒DNA所需要的酶量要比消化线性DNA的高许多倍，最高可达20倍。 侧翼序列：

8、a 大多限制酶只对两侧存在侧翼序列的识别序列起作用，如EcoRI不能对GAATTC作用，而可作用于ATGAATTCGC。 b 一些限制酶，对不同具有不同侧翼序列的限制位点的切割效率不同甚至有些位点很难被切，如NarI、NaeI、SacII以及XmaIII等。 甲基化程度：识别序列中特定核苷酸的甲基化影响酶活。,正常大肠杆菌有两种使特定核苷酸甲基化的酶：dam甲基化酶，催化GATC中A的甲基化；dcm甲基化酶，催化CCATGG中内部的C甲基化。因此，从正常大肠杆菌中分离的质粒，能被限制酶局部甚至不被消化。 解决途径：a 使用缺失甲基化酶的菌株制备质粒DNA； b 尝试同裂酶。 酶切反应的温度：不

9、同的限制酶，具不同的最适温度，低或高于最适温度影响酶活，甚至完全失活。多数限制酶的标准反应温度是37，有的低于37 ，如SmaI 25 、ApaI 30 ；有些则高于37 ，如MaeI 45 、BelI 50 、MaeIII 55 ，BstEII 60 、TaqI 65 等。,反应的缓冲液：标准缓冲液包括氯化镁、氯化钠或氯化钾、Tris-HCl、-巯基乙醇或二硫苏糖醇DTT以及牛血清白蛋白（BSA）等。 阳离子: 酶活性的正常发挥需要二价阳离子，通常Mg2+。不正确的Na或Mg2+浓度会降低酶活，还可导致识别序列特异性的改变。部分酶对Na +或K+ 变化十分敏感，而另一部分酶可适应较广变幅的离

10、子强度。 缓冲系统: TrisHCl（偶用TrisAc）, 使反应混合物的pH恒定在酶活性所要求的最佳值。绝大多数限制酶的最佳pH为7.4。 巯基试剂: 抗氧化，保持酶的稳定性。,限制酶的Star活性：在特定条件下，某些酶在非识别序列处切割DNA的现象称为Star活性。Star活性因限制酶种类、DNA和反应条件的不同而不同：高浓度酶、高浓度甘油、低离子强度、Mn2+取代Mg2+ 或高pH。几乎所有限制酶都具有Star活性，易产生Star活性的限制酶见p26。 解决途径：尽量避免，即使是降低酶活性。,DNA分子的片段化 1）单酶切 用一种限制酶切割DNA分子。环状DNA完全酶切，产生的片段数是限

11、制酶识别序列数。线形DNA完全酶切的结果，产生的片段数限制酶识别序列数加1。 底物 + 缓冲液 + H2O（酶活性/总体积往往为1U/20微升）。完全酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，紫外成像。 2）双酶切 用两种不同的限制酶切割DNA分子。 无论环状, 还是线形分子，经双酶切所产生的DNA片段的两个末端不同（同尾酶切割除外）。环状DNA完全酶切，产生的片段数是两种限制酶识别序列数之和。线形DNA完全酶切的结果，产生的片段数是两种限制酶识别序列数之和加1。 反应条件相同或相近: 可用同一缓冲系统，同时进行双酶切。完全酶切后进行琼脂糖凝胶电泳，紫外成像。,反应条件不同: a 不同温度时，先低温后高温；

12、b 不同盐浓度时，先低盐，后再高盐； c 反应系统相差很大时，第一种酶切割 后，用酚、酚-氯仿和氯仿抽提，乙醇沉淀 DNA（或电泳分离），再用第二反应系统， 进行第二酶切。 3）部分（不完全）酶切 对DNA分子上的全部识别序列进行不完全的切割。 原因：底物纯度低、识别序列甲基化、酶量不足、反应 体系和温度不适宜、反应时间不足。 结果：影响欲获得DNA片段的得率。,用途：根据DNA重组的需要，专门创造部分酶切的条件，以获得所需DNA片段；DNA分子作图。,A：完全酶切；B：部分酶切,DNA的限制性图谱 DNA分子上限制性核酸内切酶的识别序列分布图称限制性图谱（restriction map），或

13、物理图谱（physical map），见图。 限制性图谱可以是所有限制酶、也可以是部分限制酶的识别序列分布图。限制性图谱是基因工程工作者设计DNA重组的重要依据。 对于未测定序列的DNA分子来说，可用下面的一些方法绘制出它的限制性图谱。,1）双酶切法（自学） 2）部分酶切法（自学） 3）末端标记部分酶切法,E P,4）Bal 31逐步切割法 Bal 31 是一种核酸酶，能从DNA分子的两断逐个切割核苷酸。先用此酶进行不同时间的切割，再用相应的限制酶（如EcoRI）完全酶切，根据电泳结果得出限制性图谱。,3.2 DNA连接酶（ligase）,3.2.1 连接酶的功能 1）缺刻修复,2）连接两个D

14、NA分子,We usually use T4 ligase in joining DNA fragments including Sticky and blunt ends.,Mechanism: ligation takes place between 5-P and 3-OH,3.2.2 Cloning strategy 3.2.2.1 Ligating blunt ends It is very difficult to join sticky ends of DNA. Under the higher temperature (22) condition, large amount o

15、f substrates and enzyme should be used to increase the chances of the ends of the molecules coming together in the correct way.,3.2.2.2 ligating sticky ends It is very easily to join sticky ends of DNA because of hydrogen bunds formation between base pairs, the temperature can be at 16. So we should

16、 try to get sticky ends in gene cloning.,3.2.2.3 Other ways to obtain sticky ends Add linkers(连接体) to blunt ends,Linker: A short, sequence-known, synthetic ds-DNA with restriction site and blunt ends,2) Add adaptors （衔接头 ） to blunt ends,adaptor: A short, sequence-known, synthetic oligaonucleotides （

17、寡核苷酸） with sticky ends in which restriction site exists.,3.2.2.4 Directional cloning (定向克隆) It is very important to keep correct direction between the insert and linear vector, as the cloned gene must be placed downstream of promoter in correct direction.,Promoter,Terminator,AUG UAA deletion,GATCCGG

18、ATCCG GCCTAGGCCTAG result I GATCCGGATCCG GCCTAGGCCTAG result II,GATCCG GATCCG GCCTAG GCCTAG BmaHI BmaHI,Insert,Vector,Insert,Insert,Vector,Vector,1) Non directional cloning: ligation between blunt ends, one RE digestion products,GATCCG CTAGGC result III,GATCCG GATCCG GCCTAG GCCTAG BmaHI BmaHI,Insert

19、,Vector,Vector,Self ligation of vector,How to avoid self ligation of vector ? Deletion of 5-P of linear vector with BAP/CIP is a usual method,AATTCG AATTCG GCCTAG GCCTAG EcoRI BmaHI EcoRI BmaHI GATCCGAATTCG GCTTAAGCCTAG EcoRI BmaHI,2) Directional cloning: ligation between two RE digestion products,D

20、irectional cloning,Insert,Insert,Vector,Vector,Nucleases （核酸酶）: cut, shorten or degrade nucleic acid, such as Bal31, ExonucleaseIII, DNaseI, nucleaseS1. Polymerase（聚合酶）: make copies of nucleic acid, such as DNA pol.I, RTase, RNA pol. Modifying enzymes（修饰酶）: remove or add chemical groups, such as BAP

21、/CIP, polynucleotide kinase, terminal trasferase Topoisomerases（拓扑异构酶）: introduce or remove supercoils from covalently closed circular DNA (cccDNA),3.3 其他酶,3.3.1 Nucleaes 1） Exonuclease （核酸外切酶）,Bal31 Exonuclease III,2） endonuclease （内切酶）,DNase I,S1 nuclease,5-3 Exonuclease Activity 3-5 Exonuclease Activity DNA Polymerase Activity,3.3.2 DNA Polymerase （聚合酶） I,1） Alk