2015年分子生物学--4原核生物基因表达调控-6课时.pptx

1、分子生物学 生命科学与农学学院 王雪芹 Email: Tel:周口师范学院生命科学与农学学院,第十章 原核生物基因表达调控,Contents,基因表达调控的基本概念 原核基因调控机制 乳糖操纵子 色氨酸操纵子 其他操纵子 转录后水平上的调控,第一节 基因表达调控的基本概念,一、基因表达的概念 gene expression ：基因转录及翻译的过程。对这个过程的调节就称为gene regulation 。,rRNA、tRNA编码基因转录合成RNA的过程也属于基因表达,组成性表达(constitutive expression) 适应性表达(adaptive expres

2、sion）,二、基因表达的方式,1、组成性表达：,指不大受环境变动而变化的一类基因表达。,某些基因在一个个体的几乎所有细胞中持续表达，通常被称为管家基因(housekeeping gene)。,2、适应性表达 指环境的变化容易使其表达水平变动的一类基因表达。 应环境条件变化基因表达水平增高的现象称为诱导(induction)，这类基因被称为可诱导的基因(inducible gene)； 相反，随环境条件变化而基因表达水平降低的现象称为阻遏(repression)，相应的基因被称为可阻遏的基因(repressible gene)。,三、基因表达的规律 时间性和空间性,1、时间特异性（tempor

3、al specificity）,2、空间特异性(spatial specificity),基因表达伴随时间顺序所表现出的这种分布差异，实际上是由细胞在器官的分布决定的，所以空间特异性又称细胞或组织特异性(cell or tissue specificity)。,在个体生长全过程，某种基因产物在个体按不同组织空间顺序出现，称之为基因表达的空间特异性。,四、基因表达调控的生物学意义,适应环境、维持生长和增殖（原核、真核） 维持个体发育与分化（真核）,五、顺式作用元件和反式作用因子,顺式作用元件： 存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列。顺式作用元件包括启动子、增强子、调控序列和可诱导元件等，它们

4、的作用是参与基因表达的调控。顺式作用元件本身不编码任何蛋白质,仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子相互作用而起作用。 反式作用因子：是指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质。eg,RNA聚合酶 。,03年武汉大学 考研真题,六、操纵基因和阻遏蛋白,操纵基因：控制结构基因的转录，位于结构基因的附近，本身不能转录成mRNA。 阻遏蛋白：调节基因所编码的一种蛋白质，在原核生物中具有抑制特定基因产生特征蛋白质的作用。由于它能识别特定的操纵基因（即操纵子是阻遏蛋白的结合位点），当操纵序列结合阻遏蛋白时会阻碍RNA聚合酶与启动序列的结合，或使RNA聚合酶不能

5、沿DNA向前移动，阻遏转录，介导负性调节。,Contents,基因表达调控的基本概念 原核基因调控机制 乳糖操纵子 色氨酸操纵子 其他操纵子 转录后水平上的调控,第二节 原核基因调控机制,内容提要： 原核基因表达调控环节 操纵子学说 原核基因调控机制的类型与特点 转录水平上调控的其他形式,一、原核基因表达调控环节,1、转录水平上的调控 （transcriptional regulation） 2、转录后水平上的调控 （post-transcriptional regulation） mRNA加工成熟水平上的调控 翻译水平上的调控,二、操纵子学说 1、操纵子模型的提出 1961年，Monod和J

6、acob提出 获1965年诺贝尔生理学和医学奖,Jacob and Monod,2、操纵子的定义,操纵子(operon)：原核生物在分子水平上调控基因表达的单位，由调节基因、启动子、操纵基因及其所控制的一组功能上相关的结构基因所组成。操纵基因受调节基因产物的控制。,03年武汉大学 考研真题,1、根据操纵子对调节蛋白（阻遏蛋白或激活蛋白） 的应答，可分为： 正转录调控 负转录调控,三、原核基因调控机制的类型与特点,激活蛋白,正转录调控,正转录调控,如果在没有调节蛋白质存在时基因是关闭的，加入这种调节蛋白质后基因活性就被开启，这样的调控正转录调控。,负转录调控,负转录调控,在没有调节蛋白质存在时基

7、因是表达的，加入这种调节蛋白质后基因表达活性便被关闭，这样的调控负转录调控。,可诱导调节（P260）：指一些基因在特殊的代谢物或化合物的作用下，由原来关闭的状态转变为工作状态，即在某些物质的诱导下使基因活化。 例：大肠杆菌的乳糖操纵子 分解代谢蛋白的基因,2、根据操纵子对某些能调节它们的小分子的应答，可分为可诱导调节和可阻遏调节两大类：,酶合成的诱导操纵子模型,诱导物,如果某种物质能够促使细菌产生酶来分解它，这种物质就是诱导物。,可阻遏调节（P260）：基因平时是开启的，处在产生蛋白质或酶的工作过程中，由于一些特殊代谢物或化合物的积累而将其关闭，阻遏了基因的表达。 例：色氨酸操纵子 合成代谢蛋

8、白的基因,酶合成的阻遏操纵子模型,调节基因,操纵基因,结构基因,mRNA,酶蛋白,调节基因,操纵基因,结构基因,辅阻遏物,辅阻遏物,如果某种物质能够阻止细菌产生合成这种物质的酶，这种物质就是辅阻遏物。,3、在负转录调控系统中，调节基因的产物是阻遏蛋白（repressor），起着阻止结构基因转录的作用。 根据其作用特征又可分为负控诱导和负控阻遏： 在负控诱导系统中，阻遏蛋白与效应物（诱导物）结合时，结构基因转录； 在负控阻遏系统中，阻遏蛋白与效应物（辅阻遏物）结合时，结构基因不转录。,4、在正转录调控系统中，调节基因的产物是激活蛋白（activator）。 根据激活蛋白的作用性质分为正控诱导和正

9、控阻遏 在正控诱导系统中，效应物分子（诱导物）的存在使激活蛋白处于活性状态； 在正控阻遏系统中，效应物分子（辅阻遏物）的存在使激活蛋白处于非活性状态。,四、转录水平上调控的其他形式,1、因子的更换(P286) 在E.coli中,当细胞从基本的转录机制转入各种特定基因表达时，需要不同的因子指导RNA聚合酶与各种启动子结合。,大肠杆菌中的各种因子比较,温度较高,诱导产生各种热休克蛋白 由32参与构成的RNA聚合酶与热休克应答基因启动子结合,诱导产生大量的热休克蛋白,适应环境需要。,枯草芽孢杆菌芽孢形成 有序的因子的替换,RNA聚合酶识别不同基因的启动子,使芽孢形成有关的基因有序地表达。,武汉大学2

10、011年考研真题,1. Chromatin remodeling 2. Internal ribosome entry site 3. Alternative splicing 4. Non-autonomous transposon 5. Shine-Dalgarno sequence 6. Realtime PCR 7. Ribozyme 8. SOS response 9. Telomerase 10. Suppressor mutation,武汉大学2011年考研真题,1. Chromatin remodeling 染色质重塑一种重要的表观遗传学机制，是由染色质重塑复合物介导的一系列以

11、染色质上核小体变化为基本特殊的生物学过程。P301 2. Internal ribosome entry site 内部核糖体插入位点-是一段核酸序列，它的存在能够使蛋白质翻译起始不依赖于5帽结构，从而使直接从信使RNA（mRNA）中间起始翻译成为可能。 3. Alternative splicing 选择性剪接一个mRNA前体中通过不同的剪接方式（选择不同的剪接位点组合）产生不同的mRNA剪接异构体的过程，而最终的蛋白产物会表现出不同的功能和结构特性。P193,4. Non-autonomous transposon 非自主转座子需要在自主元件存在时才能够转座。P130 5. Shine-D

12、algarno sequence SD序列-细菌mRNA起始密码子AUG上游10个碱基左右处，有一段富含嘌呤的碱基序列，能与细菌16SrRNA3端识别，帮助从起始AUG处开始翻译。P232 6. Realtime PCR 实时荧光定量PCR-是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。被广泛用于监测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异。,7. Ribozyme 核酶指某些RNA的特殊结构具有催化功能，能催化它自身或其它RNA分子进行多种类型的反应。P24 8. SOS response 应急反应造

13、成DNA损伤或抑制DNA复制的过程能引起的一系列复杂的诱导反应。包括诱导DNA损伤修复、诱变效应、抑制细胞分裂等。 P110 9. Telomerase端粒酶-在细胞中负责端粒的延长的一种酶，是基本的核蛋白逆转录酶，可将端粒DNA加至真核细胞染色体末端。P96 10. Suppressor mutation 抑制突变第二次突变，它可以抑制或减轻第一次突变的表型效应。,武汉大学2011年考研真题,二、简答题 1. 简述色氨酸操纵子的调控机制。 2. DNA在复制过程中如何保持准确性？ 3. 分别阐述克隆载体和表达载体（各5种）及其特点和用途。 4. 什么是RNA editing？它的机制是什么？

14、 5. 什么是染色体步移？它的作用是什么？,武汉大学2011年考研真题,三、论述题 1. 真核生物转录调控因子的类型和特点？阐述根据一种转录调控因子的特点建立的分子生物学技术的及其应用。 2. 真核生物和原核生物的基因组的特点及差异？已知某基因的cDNA（长14Kb），如何用实验证明该生物基因还有内含子？如何确定内含子在全长中的比例？如何用实验确定某未知基因的功能？ 3. 某种基因a是诱导表达基因，在分子B（小分子化合物）的作用下可以诱导表达。已知该基因的序列，该基因上启动子的序列。已知某调控元件的序列为ACGTCG，基因c表达的蛋白C可以结合在该调控元件上，试用三种方法证明该调控元件可以诱导

15、基因a表达。,Contents,基因表达调控的基本概念 原核基因调控机制 乳糖操纵子 色氨酸操纵子 其他操纵子 转录后水平上的调控,Contents,基因表达调控的基本概念 原核基因调控机制 乳糖操纵子 色氨酸操纵子 其他操纵子 转录后水平上的调控,第三节 乳糖操纵子(lac operon),内容提要： 乳糖操纵子的结构 酶的诱导lac体系受调控的证据 乳糖操纵子调控模型 影响因子 Lac操纵子中的其他问题,2011中科院生物化学与分子生物学试题,一、乳糖操纵子的结构,Z编码-半乳糖苷酶：将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖 Y编码-半乳糖苷透性酶：使外界的-半乳糖苷（如乳糖）能透过大肠杆菌细胞壁和原生

16、质膜进入细胞内。 A编码-半乳糖苷乙酰基转移酶：乙酰辅酶A上的乙酰基转到-半乳糖苷上，形成乙酰半乳糖。,二、酶的诱导lac体系受调控的证据,安慰诱导物： 如果某种物质能够促使细菌产生酶而本身又不被分解，这种物质被称为安慰诱导物，如IPTG（异丙基- D-硫代半乳糖苷）。, Z、Y、A基因的产物由同一条多顺反子mRNA分子所编码。 启动子区(P)紧接着操纵区(O)区。 操纵区(O)是一小段序列（26bp），是阻遏物的结合位点。 当阻遏物与操纵基因结合时，lac mRNA转录起始受到抑制。,三、乳糖操纵子调控模型,RNA聚合酶结合部位,阻遏物结合部位,操纵基因的结构特征：长21bp，与启动子-10

17、区和编码链部分重叠，含反向重复序列。,操纵位点的回文序列,诱导物通过与阻遏物结合，改变它的三维构象，使之不能与操纵基因结合，从而激发lac mRNA的合成。当有诱导物存在时，操纵基因区没有被阻遏物占据，所以启动子能够顺利起始mRNA的合成。,四、影响因子,1、lac操纵子的本底水平表达 有两个矛盾是操纵子理论所不能解释的： 诱导物需要穿过细胞膜才能与阻遏物结合，而转运诱导物需要透过酶，后者的合成有需要诱导。 解释：一些诱导物可以在透过酶不存在时进入细胞？ 一些透过酶可以在没有诱导物的情况下合成？,真正的诱导物是异构乳糖而非乳糖，前者是在-半乳糖甘酶的催化下由乳糖形成的，因此，需要有-半乳糖甘酶

18、的预先存在。 解释： 本底水平的组成型合成：非诱导状态下有少量的lac mRNA合成。,2、大肠杆菌对乳糖的反应,培养基：甘油 按照lac操纵子本底水平的表达，每个细胞内有几个分子的-半乳糖苷酶和-半乳糖苷透过酶； 培养基：加入乳糖 少量乳糖,透过酶,进入细胞,-半乳糖苷酶,异构乳糖,诱导物,诱导lac mRNA的生物合成,大量乳糖进入细胞,多数被降解为葡萄糖和半乳糖（碳源和能源）,异构乳糖,乳糖,诱导物的加入和去除对lac mRNA的影响,3、阻遏物lac I基因产物及功能,Lac 操纵子阻遏物mRNA是由弱启动子控制下组成型合成的，每个细胞中有5-10个阻遏物分子。 当I基因由弱启动子突变

19、成强启动子，细胞内就不可能产生足够的诱导物来克服阻遏状态，整个lac操纵子在这些突变体中就不可诱导。,105,62,现象： 培养基中含 葡萄糖、 乳糖 lacZ等 低表达 无葡萄糖、有乳糖 lacZ等 高表达,4 葡萄糖对乳糖操纵子的影响,问题：是否有另外的调控途径？,105,63,4.1 cAMP-CRP结合位点（另一调控元件） （1）位于启动子Plac上游，与Plac部分重叠 （2）能与cAMP-CRP特异结合 （3）cAMP-CRP与该位点的结合是lac mRNA合成起始所必需的,105,64,4.2 CRP ：cAMP receptor protein (cAMP受体蛋白) 又称CAP

20、: Catabolite activator protein (降解物激活蛋白) （1）由CRP基因编码 （2）可通过与 cAMP 结合而激活，即CRP只有与cAMP结合才有活性,105,65,cAMP receptor protein,105,66,5 cAMP-CRP 的作用,CRP-cAMP 与cAMP-CRP结合位点结合，增强了RNA聚合酶与启动子的结合力，使转录效率提高50倍。,CRP的结合引起DNA链发生90的弯曲,105,67,附：葡萄糖水平与CRP的关系 CRP只有与cAMP结合才有活性，而cAMP 受葡萄糖水平的控制。 葡萄糖含量高- cAMP水平低 葡萄糖含量低- cAMP

21、水平高,cAMPCAP复合物,ATP,腺甘酸环化酶,cAMP（环腺甘酸）,大肠杆菌中：无葡萄糖，cAMP浓度高； 有葡萄糖，cAMP浓度低,无葡萄糖，cAMP浓度高时 促进转录,有葡萄糖，cAMP浓度低时 不促进转录,CAP的正调控,当阻遏蛋白封闭转录时，CAP对该系统不能发挥作用,如无CAP存在，即使没有阻遏蛋白与操纵序列结合，操纵子仍无转录活性。 cAMPCAP复合物与启动子区的结合是转录起始所必需的。,协调调节,葡萄糖对 lac 操纵子的阻遏作用称分解代谢阻遏(catabolic repression)。,单纯乳糖存在时，细菌利用乳糖作碳源；若有葡萄糖或葡萄糖/乳糖共同存在时，细菌首先利

22、用葡萄糖。,The Lac Operon:When Glucose Is Present But Not Lactose,RNA Pol.,Come on, let me through,No way Jose!,The Lac Operon:When Lactose Is Present But Not Glucose,Lac,This lactose has bent me out of shape,Bind to me Polymerase,RNA Pol.,Yipee!,The Lac Operon:When Neither Lactose Nor Glucose Is Present

23、,Bind to me Polymerase,RNA Pol.,STOP Right there Polymerase,Come on, let me through!,Contents,基因表达调控的基本概念 原核基因调控机制 乳糖操纵子 色氨酸操纵子 其他操纵子 转录后水平上的调控,第四节 色氨酸操纵子（trp operon）,内容提要： 色氨酸操纵子的结构 色氨酸操纵子的阻遏系统 色氨酸操纵子的弱化机制,2003、2011年武汉大学 考研真题,一、色氨酸操纵子的结构 调控基因 结构基因 催化分枝酸转变为色氨酸 的酶,trpR,trp,特点: (1) trpR和trpABCDE不连锁； (

24、2) 操纵基因在启动子内 (3) 有衰减子(attenuator)/弱化子 (4) 启动子和结构基因不直接相连，二者被 前导序列(Leader)所隔开,二、trp 操纵子的阻遏系统,低Trp时： 阻遏物不结合操纵基因; 高Trp时： 阻遏物+Trp 结合操纵基因,105,83,Trp 高时,Trp 低时,mRNA,O,P,trpR,调节区,结构基因,RNA聚合酶,RNA聚合酶,?,补：色氨酸操纵子动画,色氨酸操纵子,三、trp 操纵子的弱化机制,衰减子（attenuator）/弱化子 前导序列（leader sequence）,1、弱化子： DNA中可导致转录过早终止的一段核甘酸序列（123-

25、150区）。,123150,研究引起终止的mRNA碱基序列，发现该区mRNA通过自我配对可以形成茎-环结构，有典型的终止子特点。,2、前导序列：在trp mRNA5端trpE基因的起始密码前一个长162bp的mRNA片段。,3、弱化机制,前导肽,转录终止结构,105,91,前导肽,前导mRNA,RNA聚合酶,1.当色氨酸浓度低时,Trp合成酶系相关 结构基因被转录,序列3、4不能形成衰减子结构,105,92,前导序列,第10、11密码子为trp密码子,14aa前导肽编码区:,包含序列1,形成发夹结构能力强弱： 序列1/2序列2/3序列3/4,105,93,UUUU 3,前导肽,前导mRNA,2

26、.当色氨酸浓度高时,转录衰减机制,衰减子结构 就是终止子 可使转录,RNA聚合酶,终止,细菌通过弱化作用弥补阻遏作用的不足，因为阻遏作用只能使转录不起始，对于已经起始的转录，只能通过弱化作用使之中途停下来。阻遏作用的信号是细胞内色氨酸的多少；弱化作用的信号则是细胞内载有色氨酸的tRNA的多少。它通过前导肽的翻译来控制转录的进行，在细菌细胞内这两种作用相辅相成，体现着生物体内周密的调控作用。,什么是操纵子（operon)?试说明色氨酸操纵子（Trp operon)在原核基因表达调控中的调控机制和重要作用。 2003年武汉大学分子生物学试题,Contents,基因表达调控的基本概念 原核基因调控机制 乳糖操纵子 色氨酸操纵子 其他操纵子 转录后水平上的调控,第五节 其他操纵子,一、半乳糖操纵子(galactose operon),异构酶(galE) 乳糖-磷酸尿嘧啶核苷转移酶(galT)半乳糖激酶(galk)。,gal操纵子的特点： 它有两个启动子，其mRNA可从两个不同的起始点开始转录； 它有两个O区，一个在P区上游，另一个在结构基因galE内部。,二、阿拉伯糖操纵子（arabinose operon),araB基因、araA基因和araD, 形成一个基因簇，简写为araBAD,三个基因的表达受到ara操纵子中a