乳粉中克雷伯氏菌检测方法研究

1、乳粉中克雷伯氏菌检测方法研究,天津出入境检验检疫局 高 旗 利,纲 要,克雷伯氏菌（Klebsiella）简介 克雷伯氏菌检测方法研究 进口乳粉中克雷伯氏菌污染情况的普查,克雷伯氏菌简介 Klebsiella,克雷伯氏菌简介,1.分 类,肠 杆 菌 科,克雷伯氏菌属,rskov 分类法,肺炎克雷伯氏菌 K.pneumoniae,产酸克雷伯氏菌 K.oxytoca,植生克雷伯氏菌 K.planticola,解鸟氨酸克雷伯氏菌 K.ornithinolytica,土生克雷伯氏菌 K.terrigena,肺炎克雷伯氏菌肺炎亚种 K.subsp.pneumoniae,肺炎克雷伯氏菌臭鼻亚种 K.sub

2、sp.azaenae,肺炎克雷伯氏菌鼻硬结亚种 K.subsp.rhinoscleromatis,克雷伯氏菌简介,2. 定 义,符合肠杆菌科定义，具荚膜、无鞭毛的 革兰氏阴性球杆菌，大小0.50.8m 12m，单独、成双或短链状排列。发 酵阿东醇或肌醇，不产生鸟氨酸脱羧酶。,克雷伯氏菌简介,3. 生长条件,肺炎克雷伯氏菌 生长温度：2045 最适温度：37 不生长：t50 生长pH：4.510.5 最适pH: 6.58.5,产酸克雷伯氏菌 生长温度：1045 最适温度：3037 不生长： t50 生长pH：4.510.5 最适pH: 6.58.5,克雷伯氏菌简介,4. 培养特性,营养要求: 不

3、高，在普通肉汤、普通琼脂、血平板、麦康凯和SS培养基上 均可生长。 生长特征： 肉汤 ： 24h后呈混浊生长 普通琼脂平板 ：菌落呈灰白色，凸起，边缘整齐，湿润而粘稠 血平板 ：形成浓厚、灰白色、凸起而闪亮的菌落，不溶血 麦康凯和SS琼脂 ：形成粉红色，表面湿润且突起的菌落 在上述培养基上，相邻菌落可能发生融合现象。,5.生化特性,克雷伯氏菌简介,克雷伯氏菌属内种的生化特征 见下表,+：90% 阳性; （+）：75-89% 阳性; d： 种间不同菌株不定; （-）： 75-89% 阴性; -： 90% 阴性,克雷伯氏菌简介,6.致病性,肺炎 克雷伯氏菌,鼻炎 克雷伯氏菌,鼻硬结 克雷伯氏菌,产

4、酸 克雷伯氏菌,克雷伯氏菌是除大肠埃希氏菌外的医源性感染中最重要条件致病菌，易感对象为免疫力低或长期使用抗生素的人群。,易引起肺炎、支气管炎和创伤感染，有时引起严重的败血症、脑膜炎、腹膜炎和肝脓肿等。,易引起慢性萎缩性鼻炎，侵犯鼻咽部，使组织发生坏死。,易引起鼻部慢性肉芽肿性病变。,可引起脑膜炎、败血症、结肠炎和食物中毒，有的菌株产生ST和LT肠毒素。,克雷伯氏菌简介,7.婴儿奶粉中克雷伯氏菌污染几率和含量,Harry等人采用BP胨水结合EE肉汤增菌，VRBGA平板分离的方法，对35个国家141份婴儿奶粉中肠杆菌科污染情况进行了调查，按污染几率，依次为：,取样方法为：3100g、310g、31

5、g。检测结果表明：肺炎克雷伯氏菌含量为（0.3646.22）CFU/100g，产酸克雷伯氏菌污染程度为（0.361.47）CFU/100g。,克雷伯氏菌简介,8. FAO/WHO日内瓦会议,FAO/WHO于2004年5月25日在日内瓦召开了“婴儿配方奶粉中阪崎肠杆菌和其他微生物”联席会议。参会的17名专家分别来自美国、英国、荷兰等13个国家。,会议报告（Enterobacter sakazakii and microorganisms in powdered infant formula, Meeting Report,2004）将婴儿配方奶粉中病原微生物分成3类：,A 类,B 类,C 类,克

6、雷伯氏菌简介,流行病学和微生物学上都有令人信服的证据表明，被污染的婴儿奶粉是婴儿患病的传播媒介和传染源，这类微生物包括阪崎肠杆菌和肠炎沙门氏菌。,对婴儿致病，已从奶粉中检出，但无论是流行病学还是微生物学都不能很明确地表明，被污染的婴儿奶粉是婴儿传染病的传播媒介和传染源，这类微生物包括团聚肠杆菌、伤口埃希氏菌、蜂房哈夫尼亚菌、肺炎克雷伯氏菌、产酸克雷伯菌、克氏柠檬酸杆菌、 弗氏柠檬酸杆菌和阴沟肠杆菌 。,对婴儿致病，但没有从婴儿奶粉中检出，或者尽管已从奶粉中检出，但没有证据表明被污染的婴儿奶粉是婴儿患病的原因，这类微生物包括蜡样芽孢杆菌、艰难梭菌、产气荚膜梭菌、肉毒梭菌、金黄色葡萄球菌和单增李斯

7、特菌。,克雷伯氏菌检测方法研究,常规检测方法的研究,分子生物学方法的研究,检测方法研究,1. 试验用参考菌株,常规检测方法的研究,共采用参考菌株33株 ，自备菌株为本室分离或友情实验室提供，业经鉴定。,常规检测方法,检测方法研究,2. 两种预增菌培养基增菌效果的比较,（1）肺炎克雷伯氏菌CMCC46103和K.pne5830做试验菌株,稀释菌液成100至103四个稀释度。 （2）无菌称取100g乳粉，用900mL灭菌蒸馏水溶解后，将每个稀释度菌液取1.0mL分别加入，制成试验原样。 （3）取3100mL、310mL、31mL试验原样，分别加入到3900mL、390mL、39mL灭菌蒸馏水及BP

8、两种预增菌培养基中。37预增菌（1822）h，转种10mL到90mL EE肉汤中37增菌（1822）h，分别接种VRBGA分离平板培养（1824）h，挑取可疑菌落鉴定。,效果的比较（MPN/100g）（MPN/100g）,结果分析： 一般认为，BP由于具有缓冲作用和一定的营养成分，利于检样中受伤菌的恢复，但试验结果表明，BP和DW对乳粉中克雷伯氏菌增菌效果相同，两者无显著性差异。这是因为克雷伯氏菌生长最适pH值为6.58.5，值域宽，且乳粉具有很好的营养成分可以满足菌体恢复和生长的需要。,3. 各种分离培养基效果的试验观察,常规检测方法,检测方法研究,结晶紫中性红 胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）

9、,文献报道,沙门/志贺琼脂（SS）,肌醇柠檬酸盐琼脂（SCAI）,麦康凯肌醇 羧苄青霉素琼脂（MIC）,用于克雷伯氏菌分离鉴别的培养基,自行研制,麦康凯阿东醇肌醇 羧苄青霉素琼脂（MAIC）,克雷伯氏菌在各种分离培养基上的落特征观察 a:克雷伯氏菌在SCAI平板上的培养条件为37、48h，其余平板为37、（1824）h。,麦康凯阿东醇 羧苄青霉素琼脂（MAIC）,总 结,结晶紫中性红 胆盐葡萄糖琼脂（VRBGA）,文献报道,沙门/志贺琼脂（SS）,肌醇柠檬酸盐琼脂（SCAI）,麦康凯肌醇 羧苄青霉素琼脂（MIC）,用于克雷伯氏菌分离鉴别的培养基,自行研制,VRBGA平板选择性较差，所有肠杆菌科

10、细菌都能生长，菌落呈紫红色或粉红色，不易判读和分离克雷伯氏菌。,SS平板为肠杆菌科强选择性分离平板，对克雷伯氏菌属的部分菌株有抑制作用。,Eric等人根据肺炎克雷伯氏菌和产酸克雷伯氏菌利用肌醇和柠檬酸盐的生化特性研制出了SCAI分离平板用于粪便中上述两种菌的分离，SCAI分离平板是在西蒙氏柠檬酸盐琼脂的基础上，加入了1的肌醇。在SCAI平板上，典型菌落为黄色、突起、湿润、边缘整齐的较大菌落，但肺炎克雷伯氏菌CMCC46109和鼻硬结克雷伯氏菌CMCC46116生长不良。,MIC平板是根据克雷伯氏菌耐受羧苄青霉素和发酵肌醇的原理，将麦康凯培养基中1的乳糖换成了肌醇并加入了100mg/L的羧苄青霉

11、素，观察试验结果，所有克雷伯氏菌菌株、产气肠杆菌CMCC45103和团聚肠杆菌DG1在该平板上生长良好。由于发酵肌醇，产酸，克雷伯氏菌形成红色菌落，但其中肺炎克雷伯氏菌CMCC46105和鼻硬结克雷伯氏菌CMCC46116形成半透明菌落，其它试验用阴性菌株被抑制，如果以是否形成红色菌落作为主要特征来筛选可疑克雷伯氏菌的话，该平板会出现漏检，产气肠杆菌和团聚肠杆菌也形成了红色菌落。,MAIC是将肌醇与阿东醇结合在一起。结果表明，在该培养基上，所有试验用克雷伯氏菌均形成湿润、光滑、边缘整齐的红色菌落，直经为(2-4)mm，典型菌落突起、黏稠，相邻菌落会发生融合现象，从平板的背面观察，菌落具深红色心

12、。但不能区分产气肠杆菌及团聚肠杆菌，对其它试验用阴性菌株有良好的抑制作用。,常规检测方法,检测方法研究,常规检测方法,检测方法研究,常规检测方法,检测方法研究,检测方法研究,常规检测方法,4. 各种分离培养基在乳粉普查中的应用,方法： 采用VRBGA、SCAI和MAIC作为分离培养基，对100份进口乳粉进行克雷伯氏菌的分离。每份样品取3100g，分别溶于900mL灭菌蒸馏水中，37预增菌（1822）h，转种10mL到90mL EE肉汤中，37增菌（1822）h，四区法涂布平板。,结 果：,检测方法研究,常规检测方法,5. 肺炎克雷伯氏菌检测流程图,样品100 g3，10 g3，1 g3加入9倍

13、量的无菌蒸馏水 或样品100 g3加入900 mL无菌蒸馏水,10 ml加入90 mL肠杆菌增菌肉汤（EE肉汤）,MAIC,动力试验 荚膜染色 革兰氏染色 氧化酶试验 API 20E 生化鉴定 或 VITEK生化鉴定,报 告,分子生物学检测方法的研究,检测方法研究,1 肺炎克雷伯氏菌荧光PCR检测方法,引物设计：在16S-23S间区序列设计5条引物组合成5对，经试验筛选出一对引物具有较好的特异性及灵敏度。,分子生物学检测方法,检测方法研究,CGTAGGGGAACCTGCGGTTGGATCACCTCCTTACCTTAAAGAACCTGCCTTTGCAGTGCTCACACAGATTGTCTGATG

14、AAAAACAGCANTNAAAACCTCTACAGGCTTGTAGCTCAGGTGGTTAGAGCGCACCCCTGATAAGGGTGAGGTCGGTGGTTCAAGTCCACTCAGGCCTACCAAATTTGCGAAGCAAATTTGAAGAGGTTGCAAACGATGGGGCTATAGCTCAGCTGGGAGAGCGCCTGCTTTGCACGCAGGAGGTCTGCGGTTCGATCCCGCATAGCTCCACCATCTTTACTGCGAACACAAGAAAACTTCAGAGTGAACCTGAAAAGGTGCACTGCGAAGTTTTGCTCTTTAAAAATCTGGATCAAGCTG

15、AAAATTGAAACGACACACAGTTAATGTGTGTTCGAGTCTCTCAAATTTTCGCAATCAGAAGTGAAACATCTTCGGGTTGTGAGGTTAAGCGACTAAGCGTACACGGTGGATGCCCTGGCAGTCAGAGGCGATGAAGGACGTGCTAATCTGCGAAAAGCGTCGGTNAGGTGATATGAACCGTTANANCCGGCGATGTCCNAATGGGGAAACCCAGTGCNATTCGTTNCACTATTCGTAACTGGATACATAGGTTAACGAGGCGAACCGGGGGAACTGAAACATCTAAGTACCCCGAGGAAA

16、AGAAAANAANCGGG,肺炎克雷伯氏菌荧光PCR特异性试验,10株肺炎克雷伯氏菌的标准株及野生株均出现特定的扩增曲线，该菌特异性融解曲线的Tm值在85.686.2。,分子生物学检测方法,检测方法研究,肺炎克雷伯氏菌灵敏度试验,添菌量为1.6CFU/100g及16CFU/100g的4个样品经增菌后检测全部为阳性，说明该方法检测低限可以达到100CFU/100g。,分子生物学检测方法,检测方法研究,2. 产酸克雷伯氏菌荧光PCR检测方法,引物设计： 由于产酸克雷伯氏菌具有多聚半乳糖醛酸酶，所以菌落在多聚半乳糖醛酸盐半固体琼脂平板上形成程度不同的凹陷（见图）,ttcacggccaccaacct

17、gcagccggatacggagtatgcctttacggtgcgcgcggtctacgccaatggccaggaatctccggacagcgcggtggttaaagcgcaaacccgcaaaacgccgcacgtcatcgaagccagcacattcggcgcgaagggtgacggcaccacgctgaatacccaggcgctgcagcgggccattgatagctgtaccgtcacgcactatcctcagggctgcaaggtgctgatttccggcggcgaattcaaaactggcgcgttgttcctgcacagcgatatgaccctggatattgcggctggcgc

18、caccctgctgggttcggacgatccggcccagtatccgcttgataaaggctattacctctatccctatagcgatcatccgcagcctcgccgcccgccatcatta,根据该多聚半乳糖醛酸酶基因设计出一对特异性强、灵敏度高的引物。,分子生物学检测方法,检测方法研究,产酸克雷伯氏菌灵敏度试验,从图中可以看出，阳性对照的Ct值为18； 添菌量为25 CFU/100g的A、B样品，其Ct值在21附近； 添菌量为2.5CFU/100g的A、B样品，其Ct值在27附近。 灵敏度试验结果表明建立的荧光PCR方法的检测低限可达到100 CFU/100g。该菌特异性融解

19、曲线Tm值在 88.689.2之间。,产酸克雷伯氏菌特异性试验,五株阳性菌 Ct 值在23左右,11株阴性菌 均无交叉反应,分子生物学检测方法,检测方法研究,ATCC49334 ATCC49473 ATCC700324 K.oxy 5914 上海CDC69-88,肺炎克雷伯氏菌CMCC46102、鼻硬结克雷伯氏菌CMCC46116、臭鼻克雷伯氏菌CMCC46110、蜂房哈夫尼亚氏菌CMCC 45201、弗劳地枸橼酸杆菌CMCC 48021、阴沟肠杆菌CMCC 45301、普通变形杆菌CMCC 49027、痢疾志贺氏菌CMCC 51252、坂崎肠杆菌ATCC29544、大肠杆菌ATCC8739、

20、团聚肠杆菌DG1。,样品100 g3加入9倍量的无菌LST中,DNA提取 荧光PCR检测,MAIC,动力试验 荚膜染色 革兰氏染色 氧化酶试验 API 20E 生化鉴定 或 VITEK生化鉴定,报 告,进口乳粉中克雷伯氏菌 污染情况的普查,采用本文建立的传统方法对在天津口岸进境的100份乳粉进行了克雷伯氏菌检测，这些奶粉分别来自新西兰、法国、澳大利亚、芬兰、比利时、美国、丹麦、瑞士和德国，5份乳粉检出了该菌，具体情况见表。,污染情况普查,污染情况普查,食品中过敏原成分荧光PCR检测,天津出入境检验检疫局 张 霞,纲 要,过敏原情况简介 我实验室过敏原研究情况介绍 过敏原花生成分荧光PCR检测方

21、法,过敏原情况简介,过敏原情况简介,1.过敏原已被认为是严重的公共卫生问题,食物过敏是人们对食物产生的一种不良反应，属于机体对外源性物质的一种变态反应。近二十年来，被逐渐重视。根据美国FDA资料统计，在美国和欧洲，2%的成年人和5%的婴幼儿患有食物过敏症，美国每年大约30000人需要临床紧急治疗，2000人住院，150人死于食物引起的过敏反应。临床资料和调查显示，食物过敏症近年成上升趋势，甚至是成倍增长。 WHO预测可能成为最常见的流行病之一。,过敏原情况简介,2.国外对食品中过敏原成分标注的相关规定,美国2004年8月通过了“食品过敏标签和消费者保护”法案，这一法案要求自2006年1月，所有

22、可能含有过敏物源的食品成份必须标注在食品标签上。 欧共体2000/13/EC 指令也要求自2003年底起在成分标签中标注相关的过敏成分。 日本的标签标注要求将花生、蛋和奶等列为必须标注的成分，大豆、树坚果及麸质等列为推荐标注的成分。,过敏原情况简介,3. 食品中主要过敏原成分,FDA发布食品过敏原标识和消费者保护法案2004（FALCPA），规定主要食物过敏原是指含有乳、蛋、小麦、花生、大豆、鱼、甲壳类水生动物、树坚果等八种食物的成分，或是含有上述八种食物衍生的蛋白质。 在所有的过敏反应中，花生和树坚果过敏占1047，过敏死亡率的50由花生引起。在美国，花生是八种主要过敏原中最受关注的一种。,

23、过敏原情况简介,4.国内外学者针对过敏原成分检测方法的研究,以检测蛋白为基础的免疫化学检测方法，如最常见的ELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）； 以检测DNA为基础的方法有聚合酶链反应（PCR）和实时（real-time）PCR方法，以识别特定的DNA片段得到高精确度的检测结果； 将免疫学和核酸技术相结合的检测方法 PCRELISA法； 蛋白质双向电泳技术结合质谱分析确定过敏原成分。,过敏原情况简介,5. 各种检测方法的优劣比较： ELISA法,优点 灵敏度高， 操作简单， 便于普及。 美国、欧盟、加拿大 和日本均推荐使用进 行初筛。,缺点 检测致敏的特异性 蛋白，不同的试剂盒选 择的特异性蛋白不同， 检测结果也会有所不同 蛋白质不稳定， 容易造成漏检。,过敏原情