waters e2695高效液相色谱(1)

1、主讲人：马贵红 日期：2010-07-17,高效液相色谱仪操作方法,Waters e2695 型,什么是高效液相色谱法,High Performance Liquid Chromatography 高效液相色谱法，简称：HPLC 是一种基于仪器方法的高效能分离手段： 高性能的色谱柱，高精度、耐高压的输液泵以及高灵敏度的检测器 广泛应用于各个领域： 医药 / 环保 / 石化 / 生命科学 / 食品及农业 在技术，理论及应用上仍处于发展阶段,定量分析主要基于与标准品的比较 是其最大应用领域 定性分析；不是色谱的强项 基于样品的保留时间比较 借助于和其联用的紫外、质谱或其他检测器 对定量及定性分析的

2、要求 灵敏度、精度及准确度的要求 样品量的要求；复杂样品的分析能力 容易使用,什么是高效液相色谱法,高效液相色谱如何工作,一个储液瓶装有溶剂称为流动相，因为溶剂是流动的。 一个高压泵溶剂传输系统或称溶剂管理器用来产生和计量流动相的流速，一般是毫升/分钟。 一个进样器样品管理器或自动进样器可以将样品导入注射连续的流动相 ，并由流动相携带样品进入高效液相色谱柱。 色谱柱装有能获得分离效果的填料。这种填料称为固定相因为它被柱硬件包围住。 检测器用来查看化合物流出色谱柱时被分开的谱带大多数化合物没有颜色，所以人眼观察不到。 流动相流出检测器可被送至废液瓶，或按需被收集。 当流动相含有一个分开的化合物谱

3、带，高效液相色谱可以收集含有纯化的化合物的该洗脱组分，用于进一步分析。 注意高压管路和附件用来连接泵、进样器、色谱柱和检测器单元，形成流动相、样品和化合物分离谱带的通路。,检测器连接计算机数据站，高效液相色谱系统单元先记录电信号，再将电信号转换为色谱图，在显示屏上展现出来。 定性和定量样品内溶物浓度。 由于样品中化合物性质差异很大，几种类型的检测器被开发出来。 如果一个化合物能吸收紫外光，可使用紫外吸收检测器。 如果这个化合物发荧光，可使用荧光检测器。 如果该化合物没有上述性质之一，可使用更广泛的检测器，如蒸发光散射检测器ELSD。 最强大的方式是顺序使用多个检测器。例如，紫外和/或蒸发光检测

4、器可和质谱仪MS联用来分析色谱分离的组分。这样，从一次进样，可得到分析物的更多综合的信息。将质谱与高效液相色谱系统耦合称之为液质联用.,高效液相色谱如何工作,液相色谱的基本流程图,流动相,泵,色谱柱,检测器,泵输液,分离,检测,记录,进样阀,进样,液相色谱的各部分示意图,液相色谱实验所需的基本参数-亦称色谱条件 流动相：种类及配比，等度或梯度 固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量,仪器组成及开机 溶剂管理系统的准备 样品管理系统的准备 运行样品 数据采集 报告打印 关机,Waters e2695 型高效液相色谱仪操作方法

5、,Waters e2695 型高效液相色谱仪操作方法,仪器组成及开机 1 仪器组成 Waters e2695 分离单元 2498型紫外检测器 色谱管理工作站 打印机,四元梯度洗脱的溶剂输送系统,四通道在线真空脱气机,可容纳 120 个样品瓶的自动进样系统,柱温箱,内置的柱塞杆密封垫清洗系统,溶剂瓶托盘,液晶显示器,键盘用户界面及软盘驱动器,2 开机,打开电源至on位置，开机依次接通 2695 分离单元、检测器、计算机和打印机的电源。接通后，约 20s 仪器开始自检，约 1min 后，显示主屏幕，此时继续各部件的初始化。,溶剂管理系统的准备,流动相脱气确认所有溶剂管路都充满溶剂，按【 Menu/

6、Status 】，进入“ Status （ 1 ）”屏幕,溶剂管理系统的准备,必须用色谱纯有机溶剂，水或缓冲盐要用超纯水； 水相流动相需要每48h重新配制，特别是100%含水流动相； 检查6根管子是否均在液面下，必须保证6根管子全部插到溶剂瓶底部。,打开真空脱气机（degasser）,Wet prime（执行湿灌注）,流动相平衡色谱柱,同理温度、流速都可在此控制面板设定！,流动相特性,（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况； （2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。 （3

7、）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。,常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),流动相方面要求,除去微粒 纯度的要求 超纯水，梯度实验时水中有机杂质含量要低（建议走空白检验） 缓冲液的pH值，在填料的允许范围内 缓冲液（盐）的浓度 溶剂：色谱纯，并与填料相匹配 溶剂中的杂质含量 注意溶剂的相容性，避免使用不相容的溶剂 流动相对样品的溶解度 有机溶剂或水的比例,流动相的转

8、换要缓慢 流速(压力)的变化幅度较小，比较稳定 温度的变化幅度 专用色谱柱样品及溶剂的要求,色谱柱的使用及操作,装载样品盘（loading carousels）： 装入样品与转盘将样品瓶插到样品盘合适的位置，打开样品仓门，显示“ Door is Open ”屏幕，装入样品盘，按【 Next 】，直至所有样品盘装毕，关仓门。,样品管理系统的准备,样品方面要求,溶剂和样品过滤非常重要，它会对色谱柱、仪器起到保护作用，消除由于污染对分析结果的影响。 色谱柱：由于填料颗粒很细，色谱柱内腔很小，溶剂和样品中的细小颗粒会使色谱柱和毛细管容易堵塞。 仪器：溶剂和样品中的细小颗粒会增加进样阀的堵塞和磨损，同时

9、也会增加泵头内的蓝宝石活塞杆和活塞的磨损。 除去微粒及杂质 了解样品在流动相中的溶解度,如样品的溶剂不是流动相，一定要确保样品在流动相中不析出。 了解样品与色谱柱的基质/填料是否相互作用。,运行样品,配置系统项目 管理数据（相当于新建文件夹），鼠标右键选新建，设定项目名（设定后将出现在运行样品中）。 建立方法组并运行样品 在浏览项目中打开你的项目，通过“新建仪器方法”来设定使用的仪器方法（即对配置系统一步选定的主机和检测器进行参数设置）：仪器方法（新建仪器方法，包括主机和选定的检测器的参数的设置设置好选另存为保存此仪器方法关闭）此时上述编辑的仪器方法出现在列表中,运行样品,在浏览项目中打开你的

10、项目，通过“新建方法组”来设定具体仪器方法、处理方法、报告方法另存为“方法组”，设置方法名（与刚才的仪器方法名相统一）完成。,在“运行样品”中打开设定的仪器方法，并在设针时选定设定的方法组来对样品进行分析。,数据处理,都可以在“浏览项目”中完成。 点开“浏览项目”，选定要要浏览的项目，确定后进入的界面中有如下内容：样品组、进样、通道、方法、结果组、结果等。,PDA数据处理,在浏览项目中，点“通道”双击要处理的原始数据（点查看图标）进入查看主窗口提取色谱图点“处理方法向导”图标新建处理方法峰1、峰2积分区域（选定要积分的峰）给出条件剔除不要的峰纯度匹配PDA光谱对照处理方法名完成（然后又出现主窗

11、口，处理结果自动给出）点“方法组”图标，选好后点“文件”下的“另存为”“方法组”，设定即可。至此选好处理方法。 结果处理：选好数据，右键选处理选好方法组（上面设定好的） 点结果即可给出处理好的数据 注：通道无论什么时候给出的都是未处理数据。,FD数据处理： 点“处理方法向导”图标新建处理方法在新方法（方法类型中选LC）新建处理方法峰1、峰2积分区域（选定要积分的峰）给出条件剔除不要的峰处理方法名完成（然后又出现主窗口，处理结果自动给出） 至此选好处理方法。,色谱图：HPLC图形结果（Chromatogram）,色谱图即色谱柱流出物通过检测器时所产生的响应信号对时间的曲线图，其纵坐标为信号强度，

12、横坐标为保留时间。, 色谱峰,保留时间（分）,基线 ,峰高,峰宽,响应值,色谱图 参数基本概念,色谱峰 Peak 色谱柱流出组分通过检测器时产生的响应信号的微分曲线 峰底 Peak Base 峰的起点与终点之间连接的直线 峰高 Peak Height 峰最大值到峰底的距离 峰宽 Peak Width 在峰两侧拐点处所作切线与峰底相交两点之间的距离 半（高）峰宽 Peak Width at Half Height 通过峰高的中点作平行于峰底的直线，其与峰两侧相交两点之间的距离,峰面积 Peak Area 峰与峰底之间的面积,又称响应值 标准偏差； Standard Error 0.607倍峰高处

13、所对应峰宽的一半 拖尾峰 Tailing Peak 后沿较前沿平缓的不对称峰 前伸峰 Leading Peak 前沿较后沿平缓的不对称峰 鬼峰 Ghost Peak 并非由试样所产生的峰；亦称假峰,色谱图 参数基本概念,基线 Baseline 在正常操作条件下，仅由流动相所产生的响应信号的曲线 基线飘移 Baseline Drift 基线随时间定向的缓慢变化 基线噪声；N Baseline Noise 由各种因素所引起的基线波动 谱带扩展 Band Broadening 由于纵向扩散,传质阻力等因素的影响,使组分在色谱柱内移动过程中谱带宽度增加的现象,色谱图 参数基本概念,死时间，t0 Dea

14、d time 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的时间 保留时间，tR Retention time 组分从进样到出现峰最大值所需的时间 死体积，V0 Dead volume 不被固定相滞留的组分，从进样到出现峰最大值所需的流动相体积 保留体积，VR Retention volume 组分从进样到出现峰最大值所需的流动相体积,色谱图 参数基本概念,在结果中，选择图谱点打印，报告打印时，选择设定好的报告模式，或者选择 “缺醒单个报告”模式打印，在待打印的模式下可以编辑报告显示的信息，比如表头，色谱图的显示范围，表格中所需内容等。,报告打印,关 机,数据采集完毕后，关闭检测器电源开关，以节省使用寿命。 使用完毕，按规定用适当的溶剂冲洗色谱柱、系统管路、自动进样器、进样针和柱塞杆密封垫，确保 2695 分离单元已彻底冲洗干净后，关闭电源开关。 处理数据并打印报告后，关闭计算机和打印机电源开关，并做使用登记。,HPLC使用常见注意事项,1.夏季气温高，水容易生菌，要求HPLC所用重蒸水必须每天都要更新。 2.柱压变动范围较大，处理方法：多为进气泡。高低流速交替冲洗。 3. 配制的流动相使用前要脱气，常用超声脱气法：流动相放在超声波容器中，用超声波振荡10-15min，此法效果一般，但比较方便。 4.使用缓冲溶液时，做完样品后应立即用甲醇水溶