第七章 转录与转录后加工.ppt

1、第 七 章,转录与转录后加工 Transcription and Processing of post-transcription,转录 (transcription) 生物体以DNA为模板合成RNA的过程 。 DNA的遗传信息传递给RNA的过程。,转录,复制和转录的共同点:,DNA 模板 依赖DNA的聚合酶 碱基配对规律 生成磷酸二酯键 链延长方向53,复制和转录的区别,参与转录的物质,原料: NTP (ATP, UTP, GTP, CTP) 模板: DNA 酶: RNA聚合酶(RNA polymerase, RNA-pol) 其他蛋白质因子,7.1 模板和酶 Templates and E

2、nzymes,7.1.1 转录模板,模板链(template strand) DNA双链中按碱基配对规律能指引转录生成RNA的一股单链。 编码链(coding strand) DNA双链中碱基序列与RNA一致的一股链, 又称有义链(sense strand)。,5GCAGTACATGTC 3,3 c g t g a t g t a c a g 5,5GCAGUACAUGUC 3,NAla Val His Val C,编码链,模板链,mRNA,蛋白质,转录,翻译,反义RNA：以_链为模板合成的RNA，称为反义RNA。其序列与_链一致，能抑制mRNA的表达。,编码,模板,反义RNA能与mRNA分子

3、特异性地互补结合，从而抑制该mRNA的加工与翻译，是原核细胞中基因表达调控的一种方式。,5 3,3 5,模板链,编码链,编码链,模板链,结构基因,不对称转录,在DNA分子双链上某一区段，一股链用作模板指引 转录，另一股链不转录 。 模板链并非永远在同一条单链上。,7.1.2 RNA聚合酶,定义：以DNA为模板，催化三磷酸核苷（NTP） 聚合形成RNA的酶。 作用特点： DNA为模板 不需引物，游离NTP能与RNA链或另一NTP聚合. 3-OH与5-P聚合形成磷酸二酯键。 方向：53。,核心酶 (core enzyme),全酶 (holoenzyme),核心酶: 转录延长; 全酶：转录起始。 7

4、0是辨认典型转录起始点的蛋白质。,原核生物的RNA聚合酶,E.coli中不同的因子 可识别不同的启动子,RNA聚合酶全酶在转录起始区的结合,真核生物的RNA聚合酶,45S-rRNA，5S-rRNA： 核糖体RNA成分。 hnRNA： mRNA的前体。 snRNA： 参与mRNA剪切。,真核RNA聚合酶结构特点： 两个大亚基：分子量100 KDa，催化亚基， 与原核，亚基有同源性。 50 kDa亚基：分子量 50 kDa， 与原核亚基相似。 小亚基：10，7，11个。 羧基末端结构域(CTD)： (YSPTSPS)n：Y：Tyr；S：Ser；P：Pro；T：Thr RNA-pol大亚基C末端磷酸

5、化，使转录进入链的延长阶段。,RNA聚合酶与DNA聚合酶的区别,7.1.3 模板与酶的辨认、结合,5 3,3 5,结构基因,调控序列,启动子(promoter): 指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。,RNA聚合酶保护法分离启动子,目 录,蛋白酶消化,开始转录,T T G A C A A A C T G T,-35 区,(Pribnow box),T A T A A T Pu A T A T T A Py,-10 区,原核生物启动子保守序列,Sextama box,大肠杆菌RNA聚合酶全酶所识别的启动子区,T85T83G81A61C69A52,T89A89T50A65A

6、100,原核生物启动子结构特点： 一致性序列(concensus保守序列)： 碱基序列相对稳定，不易发生突变。 TTGACA：-35区，RNA聚合酶的辨认位点，亚基结合位点。 TATAAT：-10区，Pribrow盒，RNA聚合酶的稳定结合位点。亚基的结合位点。, 真核生物启动子,真核有三种不同的启动子和有关的元件 启动子最为复杂，它和原核的启动子有很多不同,真核生物启动子的结构,核心启动子（core promoter） 上游启动子元件（upstream promoter element，UPE）,1、核心启动子,定义：指保证RNA聚合酶转录正常起始所必需的、最少的DNA序列，包括转录起始位点

7、及转录起始位点上游TATA区,TATA box常在-25bp左右，相当于原核的-10序列 T85A97T93A85A63A83A50,作用：选择正确的转录起始位点，保证精确起始,2、上游启动子元件,包括CAAT盒（CCAAT）和GC盒（GGGCGG）等,CAAT盒：-70 - -80bp GC盒：-80 - -110bp,作用：控制转录起始频率。,增强子,它是在1981年由Benerji,Rusconi小组和Chambom等发现的，又称远上游序列。 其特点是： 具有远距离效应。 无方向性。 顺式调节。 无物种和基因的特异性。 具有组织的特异性。 有相位性。其作用和DNA的构象有关。 有的增强子

8、可以对外部信号产生反应。,7.2 转录过程 The Process of Transcription,7.2.1 原核生物的转录过程,转录起始,转录起始需解决两个问题： RNA聚合酶必须准确地结合在转录模板的起始区域。 DNA双链解开，使其中的一条链作为转录的模板。,辨认起始位点： 亚基辨认启动子的-35区，RNA聚合酶全酶 (2)与模板疏松结合，产生封闭的酶-启动子二元复合物（closed binary complex）， 酶滑行到-10区，通过亚基与模板牢固结合。 2. DNA双链解开: RNA聚合酶挤入DNA双链中，解链长度约20个核 苷酸，形成开放的酶-启动子二元复合体 (拓扑异构酶参

9、与)。,转录起始过程：,3. 在RNA聚合酶作用下发生第一次聚合反应，形成酶-启动子-rNTP三元复合物。,RNApol (2) - DNA - 5pppGpN- OH 3,转录起始复合物: RNA聚合酶-启动子-四磷酸二核苷酸,5-pppG -OH + NTP 5-pppGpN - OH 3 + ppi,转录延伸,1. 亚基脱落，RNApol聚合酶核心酶变构，与模板结合松弛，沿着DNA模板前移；,2. 在核心酶作用下，NTP不断聚合，RNA链不断延长。,(NMP) n + NTP (NMP) n+1 + PPi,转录空泡(transcription bubble)形成：,转录时DNA解开的两

10、条单链与RNA聚合酶及其转录产物RNA构成的转录复合物。,核心酶 DNA RNA,5,3,DNA,原核生物转录过程中的羽毛状现象,核糖体,RNA,RNA聚合酶,转录终止,终止子（terminator)：在DNA分子上（基因末端）提供转录停止信号的DNA序列。 终止子位于已转录的序列中，DNA的终止子可被RNA聚合酶本身或其辅助因子识别。,大肠杆菌中的两类终止子 所有原核生物的终止子在终止点之前都有一个回文结构，它转录出来的RNA可以形成一个茎环式的发夹结构。,根据作用方式的差别可分为不依赖因子的终止子（简单终止子、强终止子）和依赖因子的终止子（弱终止子）两类。,不依赖因子的终止子,回文对称区通

11、常有一段富含GC的序列，RNA产物除具有发夹结构外，在终止点前有一寡聚U序列。,强终止子的序列特点：,发夹式结构和寡聚U的共同作用使RNA从三元复合物中解离出来。,终止效率与二重对称序列和寡聚U的长短有关，长度 效率,茎环结构使转录终止的机理,使RNA聚合酶变构，转录停顿； 使转录复合物趋于解离，RNA产物释放。,因子：六聚体蛋白、水解各种核苷三磷酸促使新生RNA链从三元转录复合物中解离出来，从而终止转录。,依赖 因子的终止子： 必需在因子存在时，才发生终止作用。,弱终止子回文结构区不富含G-C，RNA产物在终止位点前面（发夹结构后）也无连续的U。,因子参与的RNA合成终止模式,有些终止子的作

12、用可被特异的因子所阻止，使酶得以越过终止子继续转录，称为通读（ readthrough）。,能够引起抗终止作用的蛋白质称为抗终止因子（antitermination factors)。,抗终止作用,通读往往发生在强启动子、弱终止子的基因上。,噬菌体前早期（immediate early）基因的产物N蛋白就是一种抗终止因子。它与RNA聚合酶作用使其在左右两个终止子处发生通读，从而表达迟早期（delayed early）基因。 噬菌体迟早期基因的产物Q蛋白也是一种抗终止因子，它能使晚期基因得以表达。,N蛋白利用位点（pN utilization site, nut)与nus(N utilizati

13、on substance site)因子,7.2.2 真核生物的转录,转录起始 转录延伸 转录终止,转录起始点,-25bpTATA盒,CAAT盒,GC盒,增强子,顺式作用元件(cis-acting element)：DNA分子上具有的可影响（调控）转录的序列。如启动子，增强子，沉默子。,AATAAA,切离加尾,转录终止点,修饰点,外显子,翻译起始点,内含子,OCT-1,OCT-1：ATTTGCAT八聚体,转录起始,基本转录因子 （TF，TF，TF） 直接或间接参与RNA聚合酶与启动子结合的转录因子。 特异转录因子： 特异调节特定基因转录的转录因子，决定该基因的时间，空间特异性表达。,反式作用因

14、子(trans-acting factors)：能直接、间接辨认和结合转录上游区段DNA的蛋白质。,转录因子(transcriptional factors, TF)：直接或间接结合RNA聚合酶的反式作用因子。,参与RNA-pol转录的TF,TBP：TATA binding protein, TATA结合蛋白 TAF: TBP associated factor,TBP辅因子 CTD: carboxyl terminal domain, RNA-pol大亚基羧基末端结构域,TFF,A,B,H,E,TBP,TAF,TFD-A-B-DNA复合物,TATA,A,B,TBP,TAF,TATA,H,E,

15、转录起始前复合物(pre-initiation complex, PIC),转录延伸,RNA-pol前移处处都遇上核小体。转录延长过程中可以观察到核小体移位和解聚现象。,真核生物转录延长过程与原核生物大致相似， 但因有核膜相隔，没有转录与翻译同步的现象。,RNA-Pol,RNA-Pol,RNA-Pol,核小体,转录延长中的核小体移位,转录方向,5-AAUAAA-,5 -AAUAAA-,核酸酶,-GUGUGUG,RNA-pol,AATAAA GTGTGTG,转录终止的修饰点,5,5,3,3,3加尾,AAAAAAA 3 mRNA,转录终止 和转录后修饰密切相关。,转录终止修饰点: DNA读码框下游

16、的一组AATAAA和GT共同序列。,RNA pol启动子,核心启动子（core promoter）或核心元件（core element），位于-45到+20，负责转录的起始。 上游控制元件（upstream control element UCE），从-180延伸到-107， 可增加核心元件的转录起始的效率。,UBF: 上游结合因子；结合在上游控制元件和核心启动子旁的上游位点，两个结合位点无相似性；通过蛋白-蛋白作用在两结合位点之间形成DNA环，将上游控制元件和核心启动子在空间上拉近。 SL1：选择性因子；含TBP（TATA 结合蛋白，是转录的必需因子） ；稳定UBF-DNA复合物，并作用于核

17、心启动子的下游序列；有利于POL与DNA的结合，是转录起始必需的。,RNA pol启动子,表12-6 RNA pol 启动子的转录因子的结构和功能 因子 结构 功能 TFA 38Kda,有9个锌指 结合于1型内部启动子(5sRNA基因)的A、C框， 使C结合在C框下游，辅助 B定位结合 TFB 含TBP和另外二种蛋白定位因子，使Pol结合在起始位点上 TFC 含A和B,有5个亚基 B 结合型内部启动子(tRNA基因)的B框， 起增强子的作用。A结合A框，起启动子 的作用；辅助 B定位结合 TBP是B,D,SL1的亚基和特异DNA序列及RNA Pol结合，使Pol结合 在正确的位点上,TFIII

18、C,TFIIIB,B,A,TFIIIA,TFIIIA,TBP,TFIIIB,Pol III,Pol III,TFIII C,TFIII C,boxA,boxA,boxC,boxB,转录起始点,转录起始点,1 型内部启动子,2型内部启动子,7.3 真核生物的转录后修饰 Post-transcriptional Modification,几种主要的修饰方式,1. 剪接(splicing),2. 剪切(cleavage),3. 修饰(modification),4. 添加(addition),7.3.1 真核生物mRNA的转录后加工,5端形成 帽子结构(m7GpppGp ) 3端加上多聚腺苷酸尾巴(

19、poly A tail) 甲基化修饰 RNA剪接 RNA编辑,5pppGp,帽子结构的生成,帽子结构,帽子结构的功能,(1)有助于mRNA越过核膜，进入胞质； (2)保护5不被酶降解； (3)翻译时供IF（起始因子）和核糖体识别。,3端加尾,3-末端 Poly A 尾: （长约100-200bp）,生成：在核内修饰, 与转录终止同时进行. 作用：增加mRNA稳定性，维持翻译模板活性,I：主要存在于线粒体、叶绿体及某些低等真核生物的 rRNA基因； II：发现于线粒体、叶绿体，转录产物是mRNA； III：是常见的形成套索结构后剪接，大多数mRNA基因有此类内含子； IV：是tRNA基因及其初级

20、转录产物中的内含子，剪接过程需酶及ATP。,内含子的分类,根据基因的类型和剪接的方式，通常把内含子分为4类。,II型内含子结构特点,1. 边界顺序:符合GU-AG法则(Chambon法则)。 2.二级结构的形成使两个并列的功能区靠近。 3.分枝点顺序（branch-point seguence） ：为PyNCUPuAPy ，其中A为百分之百的保守。,首先是分枝点A的2-OH对5端外显子和内含子交界处的磷酸二酯键发动亲核进攻切下外显子1，内含子5的边界序列上的G与5磷酸和分枝点A的2-OH形成磷酸二酯键，从而产生了套索（lariat）结构；,第二步是切下的外显子1，其3-OH继续对内含子3端的交

21、界序列进行亲核进攻，切下的外显子2的5磷酸和外显子1的3-OH形成磷酸二酯键，连接在一起，同时释放出套索状的内含子。,类内含子的剪接,III型内含子结构特点,1. 边界顺序:符合GU-AG法则。 2. 分枝点顺序：位于内含子3端上游18-40nt处，为PyNPyPuAPy，其中A为百分之百的保守。 3. 内含子5端有一保守序列（5GUAAGUA3）可以和U1 snRNA的5端的保守顺序3CAUUUCAU5互补。,snRNP剪接体的形成:,snRNA：(small nuclear RNA) 100-300 核苷酸，以U分类：U1-6,snRNP：(small nuclear ribonucleo

22、protein) 作为mRNA剪切的场所。,3,内含子并非都含而不显,mRNA的编辑(mRNA editing),是在RNA分子上出现的一种修饰现象。 mRNA在转录后出现核苷酸的替换，插入或缺失，改变了DNA模板来源的遗传信息，翻译出氨基酸序列不同的多种蛋白质。,人类apo B基因,mRNA（14500个核苷酸）,肝脏 apo B100 （分子量为500 000）,肠道细胞 apo B48 （分子量为240 000）,mRNA编辑,6666位CU, CAAUAA,RNA编辑的生物学意义： 基因的编码序列经过转录后修饰，可有多种的表达产物，产生多种的生物学效应，即功能用途的分化，因此也称为分化

23、加工 ( differential RNA processing ) 。,原核的tRNA加工: 原核的tRNA初始转录本多为多顺反子,存在三种排列方式： (1)串联的tRNA分子都是相同的； (2)串联的tRNA分子是不同的； (3)由tRNA和rRNA串联组成。,7.3.2 tRNA的转录后加工,原核tRNA的加工分成3个阶段 (1)“斩头”，形成5末端，工具酶为RNaseP。 RNaseP不具序列识别特异性，只识别二级结构发夹所组成的tRNA。,(2)去尾，形成3-OH末端。此过程由内切酶和外切酶的共同参与。前者识别发夹结构，后者识别CCA序列。 修整3端的外切酶是RNase D，在CCA

24、末端它一次切除（或逐步切除）3的碱基。 (3)修饰：在前体的一些专一部位的碱基需要通过甲基化酶，硫醇酶，假尿嘧啶核苷化酶等的作用进行修饰成为特殊的碱基。,真核tRNA基因和原核的差别：,(1)真核的前体分子tRNA是单顺反子，但成簇排列，基因间有间隔区； (2)真核tRNA基因一般都比原核tRNA基因多得多； (3)5端有单磷酸核苷酸，表明已被加工过； (4)tRNA的前体分子中含有内含子 位置相同，都在反密码子环的下游 不同tRNA的内含子长度和序列各异 外显子和内含子交界处无保守序列，内含子的剪切是依靠RNase异体催化进行剪切 内含子和反密码子配对形成茎环，改变了反密码子臂的结构，保护了

25、反密码子，使其免受某些酶的降解。,真核tRNA的加工步骤： tRNA的5端由RNase P切除一段多余序列。 反密码环处含有内含子剪接加工。 前体tRNA的碱基修饰,tRNA前体,TGGCNNAGTGC,GGTTCGANNCC,DNA,目 录,目 录,5前导序列：RNAaseP 中部内含子：内切酶,tRNA核苷酸转移酶、连接酶,ATP,ADP,目 录,碱基修饰,原核rRNA的转录后加工 在E.coli中rRNA有7个转录单位，名为rrnA-G，每个转录单位都含有16S、23S、5S RNA及一个或几个tRNA。 rRNA前体的加工是由RNase 负责的。,7.3.3 rRNA的转录后加工,纵列

26、串联基因：可转录的DNA片段与不能转录的间隔区串联组成的基因。（基因间隔） 高度重复序列：间隔区和可转录区可以重复数百个到数千个以上，每重复一次构成一个重复单位，转录一个rRNA，而且每个重复单位转录的rRNA大小基本一致，45S r RNA。 丰富基因：具有高度重复数目的基因，称之丰富基因。 rDNA，5s rRNA基因，组蛋白基因，免疫球蛋白,真核rRNA基因（rDNA）的特点:,真核rRNA的转录后加工,切除5端的前导序列，即外部的转录间隔序列（ETS），使45S的初始转录本变成41S的中间产物；,从41S的中间产物中先切下18S的片段，切点在18S和5.8S之间的内部转录间隔序列（IT

27、S），产物分别为20S（含18S rRNA片段）和32S；,部分退火：32S中间产物（含5.8S和28S rRNA）中的5.8S和28S之间进行退火，形成发夹结构；,最后修正：在HeLa细胞途径通过外切酶等将20S中残余的ITS切除，还要将已退火的32S中的ITS切除掉；,7.4 核 酶,具有酶促活性的RNA称为核酶。,核酶(ribozyme),四膜虫rRNA内含子的二级结构,四膜虫rRNA的剪接采用自我剪接（核酶）方式。 自我剪接（核酶）多见于型内含子。,5-端核苷酸序列,底物部分,核酶的结构特点： 通常由60个核苷酸左右组成，同一分子含有： 底物部分：含有GU序列 催化部分：锤头结构 保守

28、序列：13个碱基,人工设计的核酶,黄线表示合成的核酸分子 细线表示天然的核酸分子 X 表示一致性序列 箭头表示切断点,目 录,核酶研究的意义,核酶的发现，对中心法则作了重要补充； 核酶的发现是对传统酶学的挑战； 利用核酶的结构设计合成人工核酶 。,结束!,7.5 逆转录在分子生物学中的应用cDNA合成,DNA mRNA,RNA聚合酶,反转录酶,cDNA,cDNA 合成,7.5.1 ESTs,ESTs（Expressed Sequence tags ）是从已建好的cDNA库中随机取出一个克隆，从5末端或3末端对插入的cDNA片段进行一轮单向自动测序，所获得的约60-500bp的一段cDNA序列。

29、, 在同一物种中搜寻基因家族的新成员(paralogs)。 在不同物种间搜寻功能相同的基因(orthologs)。 已知基因的不同剪切模式的搜寻。,EST与基因识别,“5 END”,“3 END”,5,3,5,3,Sometimes part of the internal sequence of a gene is known but the sequence on the ends is not known.,7.5.2从EST到基因的分子操作RACE （Rapid Amplification of cDNA Ends）,PCR method to obtain either 5 or 3

30、 end of gene, exploiting known internal sequence for primer design,Smart cDNA 合成技术,1. SMART -RACE,SMARTSwitching Mechanism At 5 end of RNA Transcript,基因特异性引物(GSP)设计,SMART 5-RACE的操作,1. 利用mRNA的3末端的poly(A)尾巴作为一个引物结合位点，以Oligo(dT)30 MN作为锚定引物在反转录酶MMLV作用下，反转录合成标准第一链cDNA。,2. 利用该反转录酶具有的末端转移酶活性，在反转录达到第一链的5末端时自动加 上3一5个(dC)残基，退火后(dC)残基与含有SMART寡核苷酸序列Oliogo(dG)通用接头引物配对后，转换为以SMART序列为模板继续延 伸而连上通用接头。,3. 然后用一个含有部分接头序列的通用引物UPM（Universal Primer）作为上游引物，用一个基因特异引物2（Gene Specific Primer 2，GSP2）作为下游引物，以SMART第一链cDNA为模板，进行PCR循环，把目的基因5末端的cDNA片段扩增出来。,SMART 5- RACE,SMART 3-RACE的操作,1. 利用mRNA的3末端的poly(A)