研究生第六章--体外放射分析

1、放射性 核素标记物,被测物(antigen),特异结合试剂： 抗体(antibody) 特异结合球蛋白 受体蛋白 酶、微生物,竞争性 结合,被测物,标记的特异 结合试剂 （抗体）,非竞争性 结合,Non-competitive binding,RIA (Radioimmunoassay),要求： 掌握原理 把握特点 熟悉设计思想 了解计算方法,第四章 体外放射分析第一节 放射免疫分析,131I-胰岛素,抗胰岛素抗体,内源性胰岛素,高,低,负相关,兔和人血中的胰岛素量,诺贝尔 生物医学奖,Berson,Yalou,一、放射免疫分析原理,放射性核素标记的抗原 限量的抗体 被测抗原（或其标准品） 放

2、射性复合物的放射性 逆相关 被测抗原的含量,1竞争结合的反应机制,Ag,Ab,+,Ag - Ab,非标记复合物,+,*Ag,一定量,不定量,限量,*Ag-Ab,标记复合物,4,8,4,0,0,8,2,2,24,1,3,B,?,2*Ag一Ab的放射性 与Ag间的逆相关有数学基础,Po： 标记物加待测物的初始浓度 Qo： 特异性结合试剂的初始浓度 B： 标记复合物占总放射性的百分数 F： 游离标记物占总放射性的百分数 R = B/F B + F = 1 Ag-Ab = PQ, Ag = P,B + F = 1,B B 1-F PQ R = = = = F 1-B F P R 1 B = , F =

3、 1+R 1+R PoR PQ = PoB = = Po (1-F) 1+R,PQ = R(Po-PQ) = RPo - RPQ,PQ + RPQ = RPo,PQ(1+R) = RPo,PoR PQ = - = PoB 1+R,B Ag-Ab Ag-Ab PQ R = = = = F Ag Po-Ag-Ab Po-PQ,P + Q PQ PQ PQ K = = (4-1) P Q P(Qo - PQ), B与Po的函数关系, F与Po的函数关系, R与Po的函数关系,Bx,?,800,750,25.4,46.7,3剂量反应曲线(dose response curve) 是定量依据,二、剂量反

4、应曲线,1. 标准曲线斜率对定量测定的影响,甲,乙,2. 影响剂量反应曲线斜率的常见因素,(1) 反应试剂,1)抗体的亲和力,2) 抗原的用量,P + Q PQ,109L/mol,PQ K = - P Q,3) 标准抗原的免疫活性,) 标记抗原的放射性比活度与放射化学纯度,3.7GBq/mg(0.1Ci/mg) 370GBq/mmol(10Ci/mmol),95%,NSB,5) 抗体的用量,5) 抗体的用量,B=33%50%,P非标记趋于零,Po 约等于P标记,P标记4/K,P 标记趋于零,B = 0.33(33%),P标记 = 4/K,B=0.5(50%),(2) 反应方式 (3) 反应条件

5、,放射免疫分析的特点,1. 灵敏度高 检出极限为10-910-12 g / ml, 甚至可达10-15 /ml 2. 特异性强 能识别立体异构体（T3,T4,反T3） 3. 应用范围广：国外（300）,国内（100） 4. 操作简便: 试剂盒，样品不需纯化,放射免疫分析的缺点,1. 易引起误差：生物试剂 2. 时间长：温育 3. 难于超过10-15g / ml：TSH 4. 与生物活性不一定相关：免疫反应,放射免疫分析的基本流程 加样 温育 分离 测B或/和F的放射性计数 绘制剂量反应曲线 求待测抗原的含量(浓度) 签发检测报告,三 放 射 免 疫 分 析 方 法 学,RIA的方法必需具有的条

6、件, 符合一定质量要求的标记抗原 高质量的抗体 高纯度的标准抗原 合适的游离抗原和抗原抗体复 合物的分离方法,. 基 本 的 反 应 试 剂,（ ） 标 准 抗 原,标 准 抗 原 指 具 有 已 知 真 实 含 量 ， 且 不 含 对 免 疫反 应 产生 干 扰 杂 质 的 抗 原。, ） 标 准 抗 原 在 中 的 用 途, 制 备 抗 体 制 备 标 记 的 抗 原 绘 制 剂 量 反 应 曲 线,2 ） 对 标 准 抗 原 的 基 本 要 求, 标准抗原与待测抗原免疫性必须一致 标准抗原必须高纯度 结构纯、化学纯 标准抗原的量必须准确 称 量 、 溶 解 、 稀 释 、 取 样 标准抗

7、原应有很好的稳定性 避免反复冻融、小量分装保存、平行实验,1,2,3,4,5,倍 比 稀 释 法,1,2,3,4,5,倍 比 稀 释 法,1,2,3,4,5,倍 比 稀 释 法,1,2,3,4,5,倍 比 稀 释 法,100g/ml,（） 抗 血 清(antiserum),PQ PQ K =- = - (4-1) P Q P(Qo - PQ) B/F = KQo - K PQ (Scatchard方程) 斜率b = -K, PQ = Ag-Ab + *Ag-Ab PQ = B% Po,）亲和常数,示例：求抗胰岛素血清的值,经稀释的抗胰岛素血清每管加入.1ml ，标记胰岛素的比放射性为7.4ug

8、，每管加入 .1（. g），标准胰岛素的各管浓度见表-1，每管.1ml。总反应体积为0.3ml。,(B%)i = B/T100% , (B/F)i = B/T-B, PQi = (B%)i Poi, 直线延长法 b = Y/X=K = 1.105/2.6610-11 = 4.151010L/mol,1.105,2.6610-11, 直线回归法 y = 1.1175 - 0.42611011 x,y=a+bx B/F=KQo+KPQ,K=1091012L/mol B/F K=Y/X=- PQ (mol/L),） 交 叉 反 应 率 (cross reaction rate),Y 50pg 交叉反

9、应率 = - = - 100% = 0.5% X 10000pg,3) 抗 血 清 的 滴 度 指在无标准抗原 存在时，结合50%标 记抗原时抗血清的稀 释度。,滴度增加 灵敏度提高， 可测范围缩小 滴度减少 灵敏度下降， 可测范围扩大,（） 标 记 抗 原,基本概念： 在抗原的分子中，有一个或两个原子被放射性核素所取代的抗原，称为标记抗原。,（） 标 记 抗 原,要 求 标 记 抗 原 的 免 疫 活 性 与 被 测抗 原 （ 及 其 标 准 品 ） 一 致, 要 有 适 当 高 的 放 射 性 比 活 度 和 放 射 化 学 纯 度,3H: 1.08TBq/mmol(29.2Ci/mmol

10、) 125I:80.7TBq/mmol(2180Ci/mmol),1）对 标 记 抗 原 的 基 本 要 求,） 标 记 抗 原免疫 活 性 检 验, 剂 量 反 应 曲线 比 较 法 抗 血 清 稀 释曲 线 比 较 法 最 大 结 合 百 分 率 测 定 法,复合物的放射性 （Bo%）= - 100% 参与反应的标 记抗原的放射性,2. 分 离 结 合 与 游 离 物 的 常 用 方 法 （1）非 特 异 分 离 方 法,1）吸 附 法,蛋 白 质 葡 聚 糖 右 旋 醣酐,活 性 炭,2. 分 离 结 合 与 游 离 物 的 常 用 方 法 （1）非 特 异 分 离 方 法,2）沉 淀

11、法, % 饱和浓度的（4 ）2S ,聚 乙 二 醇 （ 简 称 ）,游离物,复合物,2. 分 离 结 合 与 游 离 物 的 常 用 方 法 （1）非 特 异 分 离 方 法 3）抽 滤 法,2. 分 离 结 合 与 游 离 物 的 常 用 方 法 （2） 特 异性 分 离 方 法 1）双 抗 体 法,家 兔 豚 鼠,羊 、 马,2. 分 离 结 合 与 游 离 物 的 常 用 方 法 （2） 特 异性 分 离 方 法 2）固相 抗 体 法,塑 料 纤维素 凝 胶 颗 粒 多 孔 玻 璃 微 球,2. 分 离 结 合 与 游 离 物 的 常 用 方 法 （2） 特 异性 分 离 方 法 ）葡萄

12、球菌蛋白（）沉淀法,金 黄 葡 萄 球 菌,Fc片段,IgG,Ag-Ab1,Ab2,2.分离结合与游离物的常用方法 （1）非特异分离方法 1）吸附法 2）沉淀法 3）抽滤法 （2）特异性分离方法 1）双抗体法 2）固相抗体法 3）葡萄球菌A蛋白(SPA)沉淀法,分离方式 NSB 简便快速 重复性 适用范围 吸附法 F + 小分子 过滤法 B + 沉淀法 B + 双抗法 B - 好 固相法 B + 差 A蛋白法 B + 好,分离B和F的方法比较,3. RIA 的反应方式与加样程序,(1)平衡法 (2)顺序加样法 (3)一天法,Ag,Ab,*Ag,Ag,Ab,*Ag,.放射免疫分析方法设计,RIA

13、的方法设计内容: 标记物 抗体 标准品 缓冲液 保温条件 分离B和F的方法,.放射免疫分析方法设计 (1) 标记抗原与抗体用量选择 ）标记抗原用量选择,统计误差 最低计数率 抗原的用量,放射性测量统计误差 5%,最低记数率500cpm,10%标记Ag,500/10% = 5000 (cpm),.放射免疫分析方法设计 (1) 标记抗原与抗体用量选择 寻找标记抗原的“减弱浓度”法,用不同浓 度的标记抗原 分别与系列稀 释度的抗血清 反应 ，即在同 一坐标系统绘 制多条抗血清 稀释曲线 。,（ ） 曲 线 工 作 范 围 设 计,下限值确定: 标记抗原用量 （化学量）相当 上限值确定： 绘制B/Bo

14、-log D 剂量反应曲线 高浓度段趁于水平 设置个剂量,标记抗原用量 抗血清稀释度,标记抗 原用量 抗血清 稀释度,曲 线 工 作 范 围,样品浓度低,样品浓度高,（） 反 应 介 质,（ ） 反应的容积、温度及时间,PH7.5 , 离 子 强 度: 0.050.1mol/L,1 ) 反 应 容 积: 0.31.2ml,） 反 应 温 度 与 时 间,被 测 抗 原 含 量 高：1537oC 被 测 抗 原 含 量 低: 4oC,（5）B与F分 离 方 法 选 择,方法选择 1. PEG 法 2. 双 抗 体 法 3. PEG+双 抗 体 联合,第二抗体滴度选择 最大结合率所对 应的稀释度作

15、为第二 抗体的滴度。,（6）样 品采 集 与 保 存,第七章 体外放射分析的数据处理与实验室质量管理第二节 实验室管理概述,一、质量管理基本定义 （一）临床实验室定义、功能和作用 1.定义：临床实验室是指对取自人体的各种标本进行生物学、微生物学、免疫学、化学、血液免疫学、血液学、生物物理学、细胞学等检验，并为临床提供医学检验服务的实验室。,第七章 体外放射分析的数据处理与实验室质量管理第二节 实验室管理概述,一、质量管理基本定义 （一）临床实验室定义、功能和作用 2.功能和作用：在受控情况下，以科学方式收集、处理和分析血液、体液或其他标本，在疾病的诊断、筛查、监测过程中，观察患者对治疗效果的反

16、映，提供有益的参考信息。,第七章 体外放射分析的数据处理与实验室质量管理第二节 实验室管理概述,（二）质量与质量管理 1.质量：是指一组固有特性满足要求的程度。,第七章 体外放射分析的数据处理与实验室质量管理第二节 实验室管理概述,（二）质量与质量管理 2.质量管理 （1）质量控制：是利用科学的方法对测定结果实行控制, 以达到规定的质量标准。,第七章 体外放射分析的数据处理与实验室质量管理第二节 实验室管理概述,（二）质量与质量管理 2.质量管理 （2）质量保证：提供的质量要求会得到满足的信任。,第七章 体外放射分析的数据处理与实验室质量管理第二节 实验室管理概述,（二）质量与质量管理 2.质

17、量管理 （3）质量体系：为达到质量目的，根据系统学原理，研究各项要求的相互联系和相互制约的关系，以整体优化的要求处理好各项质量活动的协调和配合。,第七章 体外放射分析的数据处理与实验室质量管理第二节 实验室管理概述,（二）质量与质量管理 2.质量管理 （4）质量管理：确定质量方针、目标和职责,在质量体系中通过诸如：质量和策划、质量控制、质量保证和质量改进，使其实施的全部管理职能的所有活动。,二、实验室误差分类及来源,（一） 误差及其分类 误 差： 实 际 测 定 的 值 与 公 认 的 “ 真 值 ” 之 间 存 在 的 差 异 称 为 测 定 误 差 。,误差分类,.系统误差 试剂变性、称量

18、、稀释不准 .随机误差 偶然 .过失误差 人为的过失,系统误差与随机误差的比较 原因 倾向 避免 评价指标 系统误差 特定 有 可以 偏差 随机误差 偶然 无 不能 精密度 _,（二）误 差 的 主 要 来 源,1. 试剂 标准品： 变性，批号，称量等 标记抗原：脱落，辐射，批号等 抗体： 储存，反复冻融等 分离剂： 配方，配制，存放等 缓冲溶液：配方，配制，变性等,2. 样品： 采集，制备，储存，测定 3. 操作: 待待加样，温度，分离等 4. 分析器具与设备: 天平，加样器等 5. 放射性测量: 衰变 6. 数据处理 : 拟合，绘制,（二）误 差 的 主 要 来 源,三、质量控制与指控样品

19、,（一）质量控制的目的和内容 1.质量控制的目的 （1）近期目的：评价本次测定 （2）远期目的：评价不同批次 2.实验室质量控制的内容 （1）实验室内质控 （2）实验室间质控,放射免疫分析的系统误差与随机误差,实验室内质量误差,实验室间质量控制,批内质控,批间质控,批内精密度评 价与偏倚分析,批间精密 度与偏倚分析,对某分析 方法试剂 或试剂盒 进行综合 评价,对不同实 验室的分 析工作质 量进行比 较,寻找误差产生的原因,改进分析工作质量,向主管部门提供信息,改进方法、试剂盒,促进实验室内部质量控制,（二） 质量控制（QC）样品,（1）对QC样品的基本要求 1) 与待测样品相同：人血清 2)

20、 与待测物免疫活性相同 3) 已知量：高、中、低 4) 足够量：分装，低温,（2） 实验室制备方法 收集血清 加入标准品,（3） QC样品的使用方法,1） 确定总数 n= 2） 组数 N=n/3 3) 排列位置 QC首,QC尾,中间,例 如 ： 需 一 次 分析100 个 样品 n = = 10 , N = n/3 = 10/3 = 3 = 3.33 = 3 QC首（1） ，QC中（51）， QC尾（100）,第三节 质 量 控 制 指 标,一、灵 敏 度 二、精 密 度 三、偏 差 和 准 确 度 四、特 异 性 五、稳 定 性 六、临 床 有 效 性,指能检测出与零标准剂 量（即Bo管）具

21、有统计差别 的最小可测剂量。,第三节 质 量 控 制 指 标 一、灵敏度,灵敏度的测试方法 1.“0”剂量点的结合率的均值减去 其二倍标准差所对应的剂量值。 2. 以零剂量点的结合率降低10%的相 应剂量值作为最小可测剂量。 3. 精密度图（P-P）图。,第三节 质 量 控 制 指 标 一、灵敏度,灵敏度的计算方法: 1) - 2SD 2) B/Bo=90% 3) 精密度图,第三节 质 量 控 制 指 标 一、灵敏度,（1）灵敏度 计算方法: 1) -2SD 2) B/Bo=90% 3) 精密度图,-2SD,第三节 质 量 控 制 指 标 一、灵敏度,-2SD,二、 精 密 度,精 密 度 是

22、 指 在 一 定 条 件 下 ， 用 同 一 实 验 方 法 检 测 多 份 同 一 样 品 结 果 的 重 复 程 度 （ 性 ） 。,指在一定条件下，用同一实验方法检测多份同一样品结果的重复性。,标准误差 SD = 当n=2时, SD = CV = SD/ CV%= SD/ 100%,二、 精 密 度,三、 偏倚和准确度,（一）偏倚 测定值-真值 偏移 = -100% 真值,回 收 实 验,回 收 率 应 在 即 偏 差 允 许 在 土 之 内,三、 偏倚和准确度,三、 偏倚和准确度,（二）准确度 A =,(CV)2 + (bias)2,准 确 度 好 精 密 度 好 偏差 小,准确度 差

23、 精密度 差 偏差 大,准确度 较好 精密度 差 偏差 较小,准确度 差 精密度 好 偏差 大,三、 偏倚和准确度,（三）Youden图,（三）Youden图,在 待 测 样 品 的 首 部 、 尾 部 各 放置 两 组 样 品 的 二 样 本 作 图 法 ， 称 为 二 样 本 图 。,系统误差和随 机误差都很小,系统误差明显 随机误差很小,两种误差 都很明显,（四）健 全 性 试 验, 标 准 品 与 待测 物 的 免 疫 学 性 质 存在明显差异。 反 应 系 统 内存 在 不 可 忽 视 的 干 扰 反 应 。 剂 量 反 应 曲 线 各 反 应 管 与待 测 样 品 管 的介 质 环

24、 境 有 较大 差 别 。,四、 特 异 性,五、稳 定 性, Bo%、 NSB%、 QC样品 有效剂量（ED25、ED50、ED75）,六、临 床 有 效 性, 正常值及其波动范围 正常值与异常值的交叉范围 诊断符合率,75%,ED75,50%,ED50,25%,ED25,第四节 实验室内部质量控制,一、批内误差分析 （一）样品复管操作误差变异系数（OPCV）,第四节 实验室内部质量控制,一、批内误差分析 （二）随机误差的期望评价 精密度图,. 图的功能, 确定RIA灵敏度 lgD-SDD截距a1.4, 定剂量反应曲线 工作范围 lgD-CVD% = 10%, 评价 I 最佳工作条件,10%

25、,第四节 实验室内部质量控制,一、批内误差分析 （一）样品复管操作误差变异系数 （二）随机误差的期望评价 （三）批内偏倚的评价 方差分析 t检验,第四节 实验室内部质量控制,一、批内误差分析 二、批间重现性评价 （一）方差分析法 （二）质控图, 无明显异常： 2SD 但 3SD,质 控 图, 随 机 误 差 较多 2SD 甚至 3SD 一定数量 3SD, 系 统 误 差 一个 3SD 二个 2SD 三个 1SD, 超长 偏差 一个QC样品超长偏差 相互接近,质控图,第四节 实验室内部质量控制,一、批内误差分析 二、批间重现性评价 （一）方差分析法 （二）质控图 （三）累积差和图, s 图, 相

26、 邻 点 间 联 结 的 斜 线出 现 连 续 上 升 或 下 降, 揭 示 有 正 偏 差 或 负 偏 差 。, 斜 线 的 斜 率 反 映偏 差的 大 小。, 3 时 ， 提示有偏差出现， 若 超 出 五 倍 ， 则 已 有 明 显 的 偏 差 发 生 。,第四节 实验室内部质量控制,一、批内误差分析 二、批间重现性评价 三、实施方法及数据处理 （一）实施方法 1.靶值和控制限 2.短期：测量三次 3.长期：质控图,第四节 实验室内部质量控制,一、批内误差分析 二、批间重现性评价 三、实施方法及数据处理 （一）实施方法 （二）数据处理,第四节 实验室内部质量控制,（二）数据处理 1.统计处

27、理 2.数据保存 3.上报数据图表 4.周期性评价 5.质量管理记录,组 织 领 导 者 的 工 作 ： 向 各 参 评 实 验 室 下 达 制 定 好 的 实 验 方 案 ， 发 放 样 品 。 统 一 处 理 各 实 验 室 提 供 的 原 始 数 据 将 处 理 结 果 反 馈 给 参 评 实 验 室 ， 并 针 对 结 果 提 出 评 价 意 见 ,参 评 实 验 室 的 工 作 : 按 统 一 方 案 与 要 求 进 行 实 验 。 定 期 向 组 织 者 提 供 实 验 信 息（ 如 ：T、 S 、 B 、 标 准 剂 量 点 及 样 品 等 反 应 管 放 射 性 测 量 的 原 始 数 据 ） 根 据 反 馈 的 信 息 认 真 查 找 产 生 误 差 的 原 因 ， 并 加 以 克 服 ， 努 力 提 高 检 测 质 量 。,外部质量评价 external quality assessment,第五节 实验室间的外部质量评价,第六章 小结1. RIA的基本原理和特点是什么？RIA 的Scatchard方程是什么？ 2. 亲和