分子生物学检测及动物试验

1、第七节 分子生物学检测,一、细菌DNA由四个碱基组成： 鸟嘌呤（G）腺嘌呤（A） 胞嘧啶（C）胸腺嘧啶（T） 严格的碱基配对： AT GC 常以GC碱基对的摩尔百分比来测定细菌DNA四个碱基对的含量来鉴定细菌。,二、细菌DNA提取过程 (一)细菌的培养及细菌收集 细菌培养：液体培养，固体培养 细菌收集：一般要求收集2-3克湿菌体 (二)细菌破壁 1. 超声波破壁法 2. 氧化铝磨碎法 3. 反复冻融法 4. 化学试剂破壁法，十二烷基磺酸钠“SDS” 5. 溶菌酶溶解法 6. 其他方法：细菌研磨法、玻璃珠研磨法。,三、细菌DNA的提取方法 (一)Marmur氯仿提取法,湿菌体23克,离心洗涤一次

2、,悬浮于3035ml 250g/L的SDS,于60加热10分钟，使之破裂,加入5mol/L NaCl(终浓度为1mol/L),置入带塞的玻璃溶器中，加入等体积的氯仿 - 异戊醇(24:1 v/v),500010000 r/min 离心5min 分层,0.1mol/L NaCl 50ml溶液,0.1mol/L EDTA pH8.0 溶液,冷却到室温后,振荡20min,上层 水相 含核酸,中层 蛋白质,下层 氯仿- 异戊醇,吸出上层含核酸的水相,加入二倍体积的乙醇,用搅拌棒搅拌,用棒卷出丝状DNA，靠壁挤干,再充分溶于1015ml 0.1 SSC,(0.15mol/L NaCl 0.15mol/L

3、柠檬酸三钠) Ph7.00.2 简称SSC 稀释10倍为0.1SSC,待全部溶解，再用10SSC(1SSC浓缩10倍),调整到约1SSC的浓度,再与等体积的氯仿-异戊醇一起振荡15min,重复一次进行清除蛋白，直到看不见变性蛋白为止,注意： 1. 被溶解的细菌浓度不能太低。 2. SDS为阴离子去污剂，各厂家、批号、等级差异较大。 3. 离心分层后，取水相液体要准确。,(二)细菌DNA中G+C摩尔百分比测定 1. 化学方法用电泳和层析等技术 2. 物理方法用热变性温度(目前常用方法) G+C摩尔百分比测定，是细菌分类鉴定的一种重要方法。缺点：不能表达出DNA碱基的排列顺序。,核酸杂交技术,核酸

4、杂交技术（technique of nucleic acid hybridization）是由现代分子生物学的重要方法之一。 是用特定标记的已知核酸序列与待测核酸进行特异性的杂交结合，形成杂交体，并利用相应的显示技术来检测目标核酸的存在及其位置的分子生物学方法。,一、核酸探针(DNA探针) 就是指带有标记物的，能与特定核酸序列发生特异性互补的已知核酸序列片段。 (一)核酸探针的种类,根据标记方法,放射性探针,非放射性探针,根据核酸性质,DNA探针,CDNA探针,RNA探针,寡核苷酸探针,1. NDA探针 DNA探针是目前最常用的核酸探针，因具有三 大优点： 这类探针克隆在质粒载体上，可无限繁殖

5、，取之不尽； DNA探针与RNA探针相比，不易降解，一般能抑制DNA酶活性； DNA探针标记方法较成熟，制备方法简便。,DNA探针一般长度在几百碱基对，可以是双链DNA，也可是单链DNA；可以是某一基因的全部序列，也可是部分序列。,2. CDNA探针 CDNA是指互补于mRNA的DNA分子(complementary DNA)， CDNA是由RNA经反转录产生的，这种DNA探针不含有内含子序列，尤其适用基因表达检测。 3. RNA探针 是一类很有前途的核酸探针，常用细胞mRNA和病毒RNA， 具有高杂交效率。但易降解，标记复杂之缺点。,4. 寡核苷酸探针 根据某一特殊核酸序列，选择其中最稳定区

6、域，经人工合成，为1830个碱基，能识别一个碱基。,具有以下特点： 由于链短，序列复杂度低，分子量小，杂交耗时短； 一次性可合成大量寡核苷酸探针； 短探针，碱基错配能降低杂交体的Tm值。,二、标记物 32P 半衰期 14.3d 35S 半衰期 87.1d 14C 半衰期 125I 半衰期 60d,三、基因重组载体 载体的功能是将一个外源基因导入受体细胞 具体的条件 1. 其本身是复制子，能自我复制。 2. 分子量小，带有选择标记。 3. 对几种限制性内切酶有单一切点。 4.并有一定非必要区，允许外源基因插入。,Southern 印迹杂交,两个主要过程： 一是将待测核酸分子通过一定方法转移并结合

7、到一定的固相支持物上(即印迹，blotting)。 二是固定于膜上的核酸同标记的探针在一定温度和离子强度下退火(复性)即分子杂交过程。,一、待测核酸样品的制备,病毒感染的细胞组织或分泌物提取DNA,酚/氯仿抽取法,用限制性内切酶消化基因组DNA,0.11g待切DNA 适当限制性内切酶缓冲液2050ul,用灭菌Eppendorf管,置合适温度下保温一个小时，加入EDTA,65加热灭活限制性内切酶,样品DNA,二、琼脂糖凝胶电泳分离待测DNA,DNA样品,0.33%琼脂糖凝胶,在一定电场下进行电泳13h,得到很多DNA条带,将电泳凝胶浸泡在0.25mol/L的HCl溶液,短暂的脱嘌呤处理,移到碱性

8、溶液(0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl),在用中性pH的缓冲液(0.5mol/L Tris-HCl pH7.5 1.5mol/L NaCl),使DNA变性并断裂形成较短的单链DNA片段,中和凝胶中的缓冲液,在20SSC中平衡凝胶10min,保持单链状态DNA片段，易于同探针杂交,三、转膜,将凝胶中的单链DNA片段,转移到固相支持物上(硝酸纤维膜),(必须保持凝胶电泳时区带位置不变),四、杂交 (一)预杂交 DNA片段与探针进行杂交前必须先进行预杂交，因能结合DNA片段的膜，同样能结合探针DNA，所以须将膜上所有能与DNA结合的位点全部封闭。 (二)正式杂交,五、放射性自显

9、影 用放射性同位素标记dNTP（2-单脱氧核苷酸），测定核酸序列是应用最早。,放射性试剂,a-32p有强放射性和散射性，少用,a-35S标记dATP，高自显影条带分辨率,Northern 印迹杂交(Northern blotting),一、原理： 是将RNA样品通过琼脂凝胶电泳进行分离 ，再转移到固相支持物上，用带标记物的探针对固相膜上的RNA进行杂交，常用于RNA病毒核酸的检测。,二、步骤,原 位 杂 交,是用特定标记的已知顺序核酸为探针，与细胞或组织中的核酸进行杂交，此杂交能保持细胞的完整性，但能对细胞或组织中的核酸进行定性、定位测定。,临床标本,组织切片,经甲醛溶液固定,经石蜡包埋,将标

10、本片和组织 片上加入探针,如果是细菌菌落 , 称菌落原位杂交 如果是细胞 , 称组织原位杂交,斑 点 杂 交,硝酸纤维素膜具有吸附单链DNA或RNA的特性，可将样品直接点在样品膜上，经变性，固定后进行杂交，称斑点杂交(dot blot hybridization)。,免疫印迹法(immunoblot),免疫印迹法，也称免疫转印技术。 1975年southern首先用于分析核酸，故称核酸印迹，southern blot。 1977年Alwine将此法用RNA研究，取名Northern blot 1979年Towbin，又扩展到蛋白分析，又称蛋白印迹。其后，Burnetle则名之为Western

11、blot，以后Gershou改称为immuno blot。 1982年Reinhart将此方法中转移电泳一步省去，而采用直接吸印法，因而把该法改良后，又称Eastern blot,基本原理：是将凝胶电泳与固相免疫测定两种方法结合起来的一种技术。,方法步骤： 1. 将抗原物质(蛋白质、多糖)通过聚苯烯酰胺凝胶电泳分离。 2. 将电泳分离的组分转移到固相基质上(硝酸纤维素滤纸)。 3. 转移后的组分进行免疫法测定。,应用范围： 1. 病原体抗原的鉴定与分析，筛选寻找特异性抗原。 2. 抗体的鉴定与分析，分析患者对不同抗原组分的抗体应答状态，目前用于艾滋病的诊断。 3. 免疫复合物的分析。,一、基本

12、原理： 是一种在体外模拟天然DNA复制过程的核酸扩增技术，但反应体系较为简单。 包括变性-复性-延伸三步循环反应。 (1)变性：通过加热(95)使双链DNA解开成单链DNA。 (2)退火(引物粘合)：当温度突然降低时(55)，浓度很高的引物与其互补的模板在局部形成杂交链，以提供DNA聚合酶催化聚合所需的3-OH末端。,聚合酶链反应 PCR,（3）聚合(引物延伸)：在Taq-DNA聚合酶、4种dNTP及Mg2+存在的条件下，聚合酶催化引物在3端不断延伸，在模板DNA链上形成新链，从而使模板DNA扩增1倍。 （4）在DNA聚酶作用下，引物扩增延伸，每经过变性、复性、延伸一个循环，模板DNA增加一倍

13、，而新合成的DNA又作为下一循环的模板，经过25-30个循环后原DNA量增加至106-109倍（拷贝）,引物的要求： 长度在15-30 bP G+C含量应在45-55%之间 碱基分布均匀，避免连续出现4个以上 自身无互补序列 两个引物之间同源碱基小于4个,以上三步构成一个循环，每一循环的产物可作为下一次循环反应的模板，大约经25-30次循环反应，可使特异性DNA片段扩增100万倍(2小时)。 （1）两种引物：为保证DNA聚合酶能够对两条互补链均能进行延伸，需要两种引物，分别位于两条互补DNA链的3-端。 引物决定了PCR扩增产物的大小及其特异性，引物设计及合成的优劣直接涉及有效扩增能否成功，引

14、物设计应考虑下述原则:,引物长度：1530个碱基为宜，引物过短会使特异性降低，引物越长，扩增的特异性越好，但敏感性相应下降。 G+C含量：在40%-60%为宜，引物Tm值可用公式计算：Tm=4（G+C）+2（A+T） 碱基分布的随机性。应尽量避免具有多聚嘌呤或嘧啶核苷酸的序列，尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。,引物自身：不应该存在互补序列，连续互补碱基不能多于3bp，否则引物自身会折叠形成发夹状二级结构。 两个引物之间不应该有多于4个的互补或同源碱基，尤其应避免3端的互补重叠，以防形成二聚体。 引物的3端：引物的3端是引发延伸的起点，因此一定要与模板

15、DNA配对，不能进行任何修饰，也不能有形成任何二级结构的可能。引物的3端最佳碱基选择是G和C，因为它们形成的碱基配对比较稳定。,引物的5端：引物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大，因此可以被修饰。引物的5端的修饰包括加酶切位点，标记生物素、荧光素、地高辛等，引入蛋白质结合DNA序列，引入突变位点等。 引物的特异性：引物与非特异性扩增序列的同源性不要超过90%或有8个互补碱基同源。,(2)耐热Taq-DNA聚合酶（Taq酶）：这是在耐热细菌体内提取的一种DNA聚合酶，可保证在95 ，30分钟以上不会变性失活。0.5-5U/100L。 (3)四种脱氧核糖核苷酸：用作底物的dNTP

16、s。20-200M。 (4)缓冲溶液：保证DNA聚合酶催化时所需的适当的溶液pH值。10-50mmol/L Tris-HCl(室温pH8.3-8.8, 72pH7.2)。 (5)Mg2+：是Taq-DNA聚合酶活性所必需。加入量比dNTPs浓度高0.5-2.5 mmol/L。,三.反应条件 (1)温度和时间 变性:95,30S；退火：45-55，30S-1min；延伸：72，1kb延伸1min,3-4kb需3-4min (2)循环次数 循环次数取决于模板DNA的浓度,理论上循环 225次后,PCR产物的累积即达最大值,但实际操作中,每步反应不可能达100%效率,一般按75%计算25-30次比较

17、合理,循环次数太少,产物的量不多,循环次数过多,会导致PCR反应”平台效应”的出现。,扩增产物分析 凝胶电泳分析法 斑点杂交分析法 酶谱分析法根据酶切位置 序列分析法,四、PCR技术的特点 1.高度的敏感性 PCR产物的生成是以指数方式增加的，它可对单拷贝基因、单个细胞、单根头发、一滴血等微量标本进行分析。 2.高度的特异性 在PCR实验中，只要引物设计合理，反应温度适宜（5055），其扩增的特异性是很高的。其它因素如：酶浓度、dNTP、Mg2+、pH等对PCR的忠实性也有一定的影响。,3.操作简便、迅速 已有多种类型的PCR扩增仪，只需把反应材料按一定的比例混合，置于仪器内，反应便会按所输入

18、的程序进行。 4.适用样品广 PCR可特异扩增任何微量（pg、ng）的目的DNA或RNA片段，样品既可以是纯化的，又可以是粗制的；既可以是新鲜组织，也可以是陈旧样品；既可以是细胞，又可以是体液；既可以是完整的大分子DNA，也可以是部分降解的DNA。因此，PCR技术对扩增样品的要求不严格。,五、PCR技术在医学中的应用 由于PCR技术敏感、特异且操作简便，加上商品化PCR试剂盒的广泛应用，使得PCR 在临床疾病的诊断、法医学鉴定中具有极为重要的应用价值，并能为大多数实验室所接受。 1. PCR用于感染性疾病病原体的诊断和研究（病毒、细菌、寄生虫检测） 2遗传性疾病及肿瘤的诊断,第八节动物试验,动

19、物试验是临床细菌学检验的重要组成部分。具有以下实用价值： 1、分离鉴定病原体 2、测定细菌的毒力 LD50、ID50 3、制备免疫血清 4、建立致病动物模型，很多疾病的机制，首先采用动物模型进行研究所证实 5、动物血液、器官是配制培养基或制备实验材料 6、用于生物制品的安检、毒理、药理测试鉴定,一、实验动物的分类 1、按遗传控制分类 (1)近交系动物（纯系动物） 指兄妹交配或亲子交配繁殖20代以上，纯系 动物具有以下优点： 具有长期遗传的稳定性 具有个体遗传的均一性 对实验的敏感性和结果的一致性 对实验结果的重复性好，可信度高。,(2)突变系动物 指正常染色体中某个基因发生了变异，具有某种遗传

20、缺陷的突变品系动物。无胸腺裸鼠,(3)杂种动物： 是指无计划随意交配而繁殖的动物。 此类动物的特点是： 生命力旺盛 对各种生存环境、食物的适应能力强 繁殖率高、生长快（如野鼠） 易于饲养 缺点：遗传特征的稳定性差，对实验重复性差 结果可信度低。,2、按微生物控制分类 (1)无菌动物 指在无菌条件下生长发育、无菌喂养，动物体内无菌，此类动物具有以下特点： 对病原体的感染受性相同 动物体内不含任何抗体 自身不患感染性疾病 对实验结果不产生任何干扰,(2)悉生动物 是指无菌动物体内（肠道）人为的引入5-17种正常菌丛培育而成的动物，此种动物的繁殖力和抵抗力较无菌动物强。 (3)无特殊病原体的动物 是

21、指严格设施标准喂养，严密监控和操作的，确无任何传染病的动物。 (4)清洁或最低限度疾病的动物。,(5)转基因动物技术 自1978年发现限制性内切酶位点多态性，并用于镰刀形红细胞贫血的诊断技术以来。重组DNA技术的发展使基因突变的诊断技术向前迈了一大步。 随着基因工程与胚胎工程技术的不断发展，转基因技术也日趋成熟。,用实验方法将外源基因导入到细胞或个体中去 方法：显微注射法 病毒载体法 精子载体法 电击或电泳冲 磷酸钙介导法 DEAE葡聚糖介导法 脂质体法 ES细胞法 原生质体融合法,二、实验动物的选择 1、首先考虑对测试菌（病原体）敏感性高的动物。 2、根据实验目的、性质和要求的不同来选用动物

22、。 3、数量要求达统计学处理标准。 4、尽可能考虑个体差异较小的动物。 5、经济、便于饲养、管理和实验操作方便,三、动物的接种途径和方法 1、皮下注射 2、皮内注射 3、肌肉注射 4、腹腔注射 5、静脉注射 6、颅内注射,四、接种后的观察及解剖,观 察,行为活动,食欲状况,粪便特征,注射部位的变化,解剖,解剖前的消毒处理,固定动物,剪开皮肤,打开胸、腹腔,取样,解剖后的处理,五、动物采血 家兔：取静脉、心脏 绵羊：颈静脉 鸡：心脏 小鼠：尾部,第九节 细菌的分类命名,一、分类原则:细菌的分类原则上分为传统分类和种系分类。,分类方法： （1）人为分类法： 以细菌形态和生理生化特征为依据，分为： 传统分类法 和 数值分类法 （2）系统分类法： 以细菌大分子物质（核酸、蛋白质）结构的同源程度进行分类，称为种系分类或自然分类,具体到细菌鉴定和分类的方法包括 表型分类：以细菌的形态和生理特征为依据的分类方法，即选择一些较为稳定的生物学性状，如菌体形态与结构、染色性、培养特性、生化反应、抗原性等作为分类的标记，它奠定了传统分类的基础。,分析分类：应用电