3、RNA指导的DNA复制(逆转录)及病毒的复制

1、rna replication,reverse transcription=replication,逆转录酶 （reverse transcription),1964年，temin发现rous肉瘤病毒等rna病毒所造成的感染可被dna合成抑制剂遏制。 表明：rna肿瘤病毒的rna复制过程中要合成dna。 temin又发现放线菌素d能抑制致癌rna病毒的复制，但不能抑制一般rna病毒的复制。 表明：转录对于rna病毒增殖是必需的。,temin提出前病毒假说：原病毒dna是rna肿瘤病毒在复制和致癌中的中间物。 1970年，temin 在rouse肉瘤病毒、baltimore在白血病病毒中发现逆转

2、录酶。,多功能酶：,1、rna指导的dna聚合酶活性 2、rna酶h（rnaseh）活性：水解rna-dna杂交体上的rna 3、dna指导的dna聚合酶活性：合成互补dna。 4、没有35外切酶活性。,特点：,含有zn2+（是否有锌指结构、dna结合功能？） dna合成反应要求有模板和引物。 需适当浓度的二价阳离子（mg2+、mn2+） 5 3合成方向,逆转录病毒的基因组复制过程,第一阶段：合成负股cdna的大部分 第二阶段：以负股dna为模板合成一小部分正股dna链。 第三阶段：完成cdna的全部复制。,乙肝病毒基因组的复制,其复制需通过逆转录过程经rna中间体实现 ，其dna聚合酶也是一

3、种逆转录酶。,逆转录病毒：rna dna rna 乙肝病毒：dnarna dna,试管内cdna的合成,常用于获得或研究真核生物基因的方法。提取某一种特定的mrna，经逆转录生成的cdna可代表某一特定基因。 常用的逆转录酶有两种： 来自鸟类成髓细胞瘤逆转录病毒称为amv-rt； 来自鼠白血病毒称为mmlv-rt。,病毒rna复制的主要方式,1、病毒含有正链rna，如灰质炎病毒。rna（+） 蛋白质（酶） rna复制 2、病毒含有负链rna和复制酶如狂犬病毒。rna（-） rna（+） 蛋白质、复制病毒rna（-）。 3、病毒含有双链rna和复制酶。如呼肠孤病毒。双链rna rna（+） 蛋白

4、质 rna（-） 双链rna 4、逆转录病毒。,讨论题,如何知道dna复制中先要有rna引物的合成？ (原料/新合成dna序列分析/专一核酸酶水解),病毒的复制,病毒在活细胞内，以其基因为模板，在酶的作用下，分别合成病毒基因及蛋白质，再组装成完整的病毒颗粒，这种方式称为复制（replication)。 从病毒进入宿主细胞开始，经过基因组复制和病毒蛋白合成，至释放出子代病毒的全过程，称为一个复制周期。 病毒的复制周期主要包括吸附和穿入、脱壳、生物合成、组装和释放四个连续步骤。,复制周期,病毒的一步生长曲线,病毒的一步生长曲线：以感染时间为横坐标，病毒效价为 纵坐标，绘制出的病毒特征曲线。,一、吸

5、附和穿入,（一）吸附(adsorption) 分两个阶段： 静电吸附：病毒体与细胞接触，进行静电结合。非特异性、可逆。 真正的吸附：病毒体表面位点（蛋白质结构）与宿主细胞膜上相应的受体结合。是决定病毒感染的真正开始。,裸露病毒的吸附,囊膜病毒的吸附,（二）穿入(penetration) 病毒体吸附在宿主细胞膜上后，可通过数种穿入方式进入细胞：,1.无囊膜的病毒 一般经过细胞膜吞入，称为病毒胞饮,如腺病毒、小rna病毒等,病毒胞饮,2. 有囊膜的病毒 囊膜与宿主细胞膜融合，病毒的核衣壳直接 进入细胞浆内 病毒胞饮: 细胞膜吞入,(1) 膜融合后进入,(2) 病毒胞饮,二、脱壳(uncoating

6、) 不同病毒脱壳方式不一，多数在宿主细胞溶酶体酶作用下脱壳，释放出基因组核酸。,三、生物合成(biosynthesis),病毒基因组一旦从衣壳中释放后，就利用宿主细胞提供的低分子物质合成大量的病毒核酸和结构蛋白。 早期，根据病毒基因组转录成mrna、指令合成转录合成所必需的复制酶和一些抑制蛋白； 生物合成阶段，病毒处于隐蔽期 病毒的生物合成过程可基本归为6大类：双股dna病毒、单股dna病毒、单正股rna病毒、单负股rna病毒、逆转录病毒和双股rna病毒。,病毒dna,早期mrna,早期蛋白（酶等）,子代病毒dna,晚期mrna,病毒结构蛋白,子代病毒子,双股dna病毒,复制,宿主细胞转录酶,

7、单链正股rna病毒,（-）ssrna,亲代病毒（+）ssrna,早期蛋白,（+）ssrna,dsrna复制中间型,（-）ssrna,（+）ssrna,大量子代（+）ssrna,晚期蛋白,装配子代病毒,单股负股rna病毒,病毒自身携带依赖rna的rna多聚酶。,亲代（-ssrna）,（+）mrna,蛋白质,（+）ssrna,子代（-）srna,子代病毒,多聚酶,逆转录病毒,四、组装,病毒核酸与衣壳装配在一起，形成病毒子。 绝大多数dna病毒均在细胞核内组装; rna病毒和痘病毒在细胞浆内组装。,绝大多数无囊膜病毒释放，一次同步，破坏宿主细胞膜，细胞裂解释放病毒颗粒，细胞迅速死亡。 绝大多数有囊膜

8、病毒以出芽方式释出时包上细胞核膜或细胞膜而成为成熟病毒。逐个释出，非一次同步，细胞死亡缓慢。,五、释放,virus obtaining its envelope from host cell membrane by budding,复制周期,思考题1,某种病毒dna的碱基组成（摩尔百分比）如下： a=32；g=16；t=40；c=12 该病毒dna的特点如何？,思考题2,简要说明怎样进行构建cdna文库？,思考题3,组织培养的哺乳动物细胞s期长达5 小时，经放射自显影测定dna复制的速度是0.5微米/分，已知哺乳动物细胞dna全长1.2米，计算染色体复制时共有多少复制叉在复制？ 8103（如何分析？）,思考题4,已知抹香鲸和猪的胰岛素