病毒学Virology(1)

1、,病毒学（Virology）,病毒学是研究病毒这一特殊生命形式的性质及其与宿主相互作用的关系的自然学科，是跨生物学、医学、农学的交叉学科，是分子生物学研究领域的前沿学科。,第一章 绪论,第一节 病毒学研究的对象与任务 一、病毒学研究的对象 病毒（Virus）是一种特殊的生命形式，是一种极为简单的生命形式。,（一）病毒的特点,1、病毒结构简单 (1)不具有细胞结构 (2)只具有一种核酸（DNA或RNA） (3)不含核糖体和完整的酶系统，也不具有能量合成和代谢系统。 2、独特的繁殖方式 (1)不具有双分裂 (2)以复制方式进行繁殖 3、绝对的细胞内寄生,4、病毒的二重性,(1)病毒存在形式的二重性

2、 *细胞外具有感染性的颗粒形式 *细胞内具有繁殖性的基因形式 (2)病毒结构形式的二重性 *完全病毒与缺损病毒（defect virus） *病毒与假型病毒(pseudo type virus)、假毒粒(pseudovirion) *病毒颗粒与空壳 (3)病毒来源的二重性 * 外源性病毒 从细胞外到细胞内在细胞间水平传播的病毒 * 内源性病毒 在宿主发育早期感染宿主，病毒基因组整合于宿主基因组并与其同步复制，随细胞分裂垂直传递给子代细胞，但因其受宿主细胞控制，病毒基因组只能部分表达，故没有子代病毒产生，且对宿主一般不造成伤害。,（二）病毒的定义,病毒是占据一定生境，并具有独立于其宿主进化史的绝

3、对细胞内寄生物，其基因组（DNA或RNA）被其自身编码的蛋白质外壳所包围。,(三）、病毒的宿主范围,宿主范围：病毒所能感染的宿主和宿主细胞的种类 按宿主种类划分,Euvirus Virus Subvirus Viroid Satellite agent Satellite RNA Satellite virus Prion,虫媒病毒（arbovirus） 以蚊、蜱、螨、白蛉等节肢动物为媒介，在脊椎动物中广泛传播的病毒。,（四）、病毒的起源,三种假说： 病毒起源于细胞的DNA/RNA 病毒的退行性进化假说 病毒起源于具有复制能力的寡聚核苷酸,四、病毒学研究任务,理论方面：推进现代生物学的发展 应

4、用方面： 控制和消灭危害人类健康和社会发展的病毒危害 利用病毒对有害生物进行生物防治 促进生物高新技术的发展,第二章 病毒学研究的基本方法,一、病毒的分离,（一）标本的采集与处理 （二）标本的接种： 实验宿主（动物、植物或细菌）， 鸡胚或细胞培养 （三）病毒存在的认定 1、系统症状,2、局部反应 (1)噬菌体噬菌斑(plaque) 噬菌体感染生长在营养琼脂平板上的细菌所形成的，具有一定大小和形状的透明区域。 (2)动物病毒蚀斑或称空斑(plaque) 动物病毒感染单层细胞培养所形成的局部病损区域，系由病毒的致细胞病变作用所引起,致细胞病变作用（Cytopathic effect ， CPE）

5、： 病毒感染细胞培养引起的细胞显微表现的改变，如细胞聚集成团，肿大、园缩、脱落、细胞融合形成多核细胞、细胞内出现包涵体（inclusion body），乃至细胞裂解等 （）植物病毒坏死斑或称枯斑（necrosis spot） 植物病毒感染敏感植物叶片所形成的局部病损区域,（四）盲传（blind passage） 将取自经接种而末出现感染症状的宿主或细胞培养的材料，再接种于新的宿主或细胞培养，以提高病毒的毒力或效价,二、病毒的纯化,(一)病毒的纯化 1.病毒纯化的标准 (1)纯化的病毒制备物应保持感染性 (2)纯化的病毒制备物应具有均一性 病毒制备物均一性检查的方法 包括：电镜检查、超速离心、电

6、泳和免疫学方法,（二）病毒纯化的方法,1,病毒纯化方法的依据 (1)病毒颗粒具有一定的大小和密度，在离 心场中能以一定的沉降速率沉降 (2)病毒颗粒的主要化学组成为蛋白质 2.病毒纯化的方法 包括:超速离心,沉淀法,凝集技术,液态两相分配系统,有机溶剂萃取,层析和电泳等,三、病毒的测定（assay of vrvuses）,病毒的测定即病毒的定量分析 (一) 病毒的物理颗粒计数 1. 电镜计数，将待测病毒样品与已知数目的聚苯乙烯乳胶颗粒均匀混合后置电镜观察，统计病毒颗粒数目与乳胶颗粒数目，根据两类颗粒数目之比即可计算出待测样品中的病毒颗粒数目。,2.血细胞凝集试验 血细胞凝集作用（Hemaggl

7、ution） 许多动物病毒的包膜蛋白或外壳蛋白在一定条件下（温度、pH、离子浓度等）能引起体外的一定种类的脊椎动物红血球细胞凝集，此即血细胞凝集作用。 血细胞凝集试验 由于具有血凝性质的病毒所能凝集血细胞的量与病毒浓度成正比，根据这一原理设计的血细胞凝集试验即可用于病毒定量测定。,待测病毒样品 2倍稀释,1:1,1:10,1:20,1:40,1:80,1:160,1:320,1:640,1:1280,1:2560,每孔分别加入等体积一定浓度的红球血细胞,置室温孵育一定时间,观察结果并计算病毒血凝效价,（二）病毒的感染性测定（assay of viral infectivity）,*感染性测定测

8、定因感染所引起宿主或细胞培养某一特异性感染反应的病毒数量。 *感染单位（infectious units, IU）:引起宿 主或宿主细胞培养一定特异性反应的病毒最小剂量 *效价（title）：单位体积（ml）病毒原液所含的病毒感染单位的数目（I/ml）。,1、 噬（蚀）斑测定 （1）噬菌体的噬菌斑测定，琼脂叠层法（agar layer method） 一定量的经系列稀释的噬菌体悬液分别与高浓度的敏感细菌，以及半固体营养琼脂均匀混合后，塗布在已铺有较高浓度营养琼脂的平板上，经过孵育培养，在延伸成片的细菌菌苔上出现分散的单个噬菌斑。根据病毒的一次击中（one-hit）动力学性质，一个有感染性的病毒

9、即可引起一个细胞的感染并形成一个噬斑，并且其数目与样品中有感染性的噬菌体颗粒数量成正比，故统计噬斑数目后即可计算出噬菌体悬液效价，并以噬斑形成单位（plague forming units ， PFU）/毫升（ml）表示。,、动物病毒的蚀斑测定 空斑测定 转化测定 合胞体计数 、植物病毒的环死斑测定 半叶法,、终点法（end point method） 取等体积的经倍比稀释的病毒系列稀释液分别接种大量同样的试验单元（如实验动物、鸡胚或细胞培养），经过一段时间孵育后，以试验单元群体的半数（50%）个体出现某一感染反应的病毒剂量，来确定病毒样品的效价，称做半数效应剂量，并以50试验单元出现感染反应

10、的病毒稀释度的倒数的对数值表示。 根据试验单元及感染反应的性质分为： 半数致死剂量（50% lethal dose, LD50） 半数感染剂量（50% infective dose, ID50） 半数组织培养感染剂量（50% tissue culture infective dose, TCID50）,终点测定实验记录举例,根据Reed和Muench方法 半数效应剂量(LD50, ID50或TC ID50) =50%感染率的高临界稀释度倒数的对数距离比稀释系数的对数 上式中： 距离比 在上例中，距离比71-50/71-13=0.36 稀释系数为10 故LD50=log1/10-3+0.36Xl

11、og10=3.36 即该待测样品的LD50效价是10-3.36,四、病毒的鉴定,（一）根据病毒感染宿主的范围及感染表现的鉴定 1、病毒感染的宿主范围 宿主谱 2、病毒感染的症状表现 感染宿主机体疾病症状 感染鸡胚在鸡胚绒毛尿囊膜上形成痘疱（pock）的形态。 感染细胞培养致细胞病变效应表现 3、病毒的传播途径与传播媒介,（二）病毒的理化性质鉴定 1、电镜技术 2、分析超速离心技术 (三)病毒对理化因子敏感性的鉴定 （1）病毒对DNA合成抑制剂的敏感性试验 （2）脂溶剂敏感试验 （3）耐酸性试验 (4) 温度敏感试验 (5) 紫外敏感试验,(四)红细胞凝集性质的鉴定 不同的具有血凝活性的病毒，其

12、凝集谱、发生凝集反应的条件（温度、pH）都有可能不同,据此可以对病毒进行鉴定。 (五)病毒的免疫鉴定 免疫沉淀反应，凝集反应，酶联免疫吸附测定，免疫莹光技术，免疫电镜技术、放射免疫技术、单克隆抗体技术等。 血凝抑制试验：特异性的病毒抗体与病毒表面有凝集活性的表面蛋白结合，可抑制血细胞凝集反应发生。,中和试验： 在病毒的中和作用（neutralization）性质上建立，即某些特异性的病毒抗体与病毒作用后，能够使其失去感染性，抑制病毒的繁殖。这类病毒抗体称做中和抗体（neutralizing Abs） 。并且一种病毒的感染性只能被其特异性的中和抗体中和，而中和一定量的病毒的感染性必须有一定效价的

13、抗血清。,(六)分子生物学方法 *变性与不变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳 *蛋白质肽图与N末端氨基酸分析 *核酸的酶切图谱与寡核苷酸图谱分析 *分子杂交 *序列测定 *聚合酶链反应（PCR）等,第三章 毒粒的性质,第一节 描述毒粒性质的结构术语 一、毒粒（Virion） 1、毒粒是一团能够自主复制的遗传物质（DNA或RNA），它被自身编码的蛋白质外壳所包围，有的还有一层附加膜，以保护其遗传物质免遭环境破坏，并作为将其遗传物质从一个宿主细胞传递给另一个宿主细胞的载体。 2、毒粒的基本构成：一个核酸分子（DNA或RNA） 蛋白质外壳（由许多相同的蛋 白质分子构成） * 有的病毒含有多个核酸分子 * 有的

14、病毒蛋白质外壳由数种不同的蛋白质分子构成 * 有的病毒蛋白质外壳外还有一层膜结构 * 有的病毒的多个核酸分子被分别包装在不同的颗粒中,3、分段基因组（segmented genome） 病毒基因组由数个核酸分子构成，只有这些核酸分子同时存在病毒才具有感染性，其各个核酸分子称之为节段（segment）。 4、多分体病毒（multicomponent viruses）: 具分段基因组的病毒各个核酸节段分别包装在多个颗粒中，只有这些颗粒同时存在病毒才能够复制，个别颗粒感染病毒不能复制，多分体病毒主要见于植物RNA病毒中。,二、壳体（capsid），又称衣壳，其同义语是外壳（coat） 包围着病毒核酸

15、及其结合蛋白的蛋白质鞘(shell)。 三、蛋白质亚基（protein subunit），其同义语是原体（protomer）或结构单位（structure unit） 以次级键结合构成病毒壳体的蛋白质单体。结构简单的病毒壳体仅由大量相同的蛋白质亚基构成，一些复杂的病毒壳体可能由多种不同的蛋白质亚基构成。,四、壳粒（capsomer），又称子粒，其同义语是形态学单位（morphological unit） 在病毒的二十面体壳体构成中，一定数量的蛋白质亚基以特殊方式聚集形成的，在电镜下可见的结构。 蛋白质亚基 聚集 壳粒 聚集 二十面体壳体 五聚体（pentamer）:由5个蛋白质亚基聚集形成 六

16、聚体（hexmer） :由6个蛋白质亚基聚集形成,五、核心（core） 由病毒核酸及其结合蛋白组成，并被壳体包围的毒粒的中心部分。一些复杂病毒的核心结构较为复杂，这类病毒的核心常称做类核（nucleoid） 六、核壳（nucleocapsid），又称衣壳 壳体与核心一起构成的复合物，一些简单的病毒的毒粒就是一个核壳结构。 七、包膜（envelope），又称囊膜 包膜是病毒核壳外的膜结构，系病毒以芽出方式（budding）成熟时，由细胞膜衍生而来的脂双层膜，其中的膜蛋白是病毒基因编码的。 八、钉状物（spike） 病毒表面向外凸出的突起,多见于有包膜病毒的包膜表面,包膜表面的钉状物称做包膜突起（

17、peplomer）,第二节毒粒的化学组成 毒粒的基本组成包括：核酸 蛋白质 脂类 碳水化合物 其它组分 一、病毒的核酸 （一）核酸是病毒的遗传物质 DNA是DNA病毒的遗传物质 Hershey chase (1952) E.Coli phage T2 搅拌试验 RNA是RNA病毒的遗传物质 Fraenkedl conet, singer(1955) Gierer , schrcmm (1957) Tobacco mosaic virus 体外重建试验,(二)病毒核酸的碱基组成含量和类型 1、病毒核酸的碱基组成 病毒DNA的碱基组成： A、T、G、C 病毒RNA的碱基组成： A、T、G、U 有些

18、噬菌体的DNA中含有稀有碱基 Bacillus subtilis phage SP8 UC E.coli phage T4 5-HMCC 2、含量和分子量 不同的病毒核酸含量不同 T-even phage 50% TMV 5% Influenzavirus 1% 不同的病毒核酸的分子量差异很大 细小病毒 （Parvoviruses） 1.5x106 痘病毒 (Poxviruses) 150 x106,2、末端重复（terminal repeats） 基因组核酸分子两端存在的相同核苷酸序列 3、倒转末端重复（inverted terminal repeats） 基因组核酸分子两端存在的互补核苷酸

19、序列 ABC ABC ABC CBA ABC ABC 或 ABC CBA,A,B,C,A,B,C,A,B,A,B,C,C,或,或,4、循环排列（ciraular permutation） 多个病毒颗粒中随机包装的双链DAN分子有相同的基因顺序，但末端的序列有所不同 ABCDEFGAB BCDEFGABC CDEFGABCD 5、5末端的帽子结构（Cap Strueture） 大多数真核正链RNA（+RNA）病毒的基因组RNA和双链RNA病毒的基因组RNA的正链的5端均有55结合的7-甲基化鸟苷酸残基封闭结构，其RNA链的第一个核苷酸亦甲基化，这种完全甲基化的末端寡核苷酸（m7G5-ppp5Nm

20、pNp）即称做为帽子结构。,6、3末端聚腺苷酸的尾 大多数真核正链RNA（+RNA）病毒的基因组RNA5端具有poly(A) 7、5端共价结合蛋白 某些病毒（Adenoviruses, Hepadnaviruses）基因组核酸链的5端共价结合的蛋白质。,(四)病毒核酸的类型,（1）按其链数划分 线状 ssDNA DNA dsDNA RNA ssRNA dsRNA 线状,线状,环状,环状（仅HDV）,环状,线状,（2）按核酸的感染性区分 *转染：与有感染的毒粒所进行的病毒遗传物质传递相区别。将从毒粒或病毒感染的细胞中分离纯化的病毒核酸直接导入细胞，现在已用来泛指将外源核酸直接导入培养的细胞。 依

21、赖宿主的转录酶进行转录的病毒DNA有感染性 依赖病毒毒粒携带的病毒转录酶进行转录的病毒DNA无感染性 其基因组RNA具有mRNA活性，可直接作为翻译模板则有感染性 其基因组RNA序列与其mRNA互补，需经病毒毒粒所携带的依赖于RNA的RNA聚合酶转录产生mRNA则无感染性,DNA病毒,RNA病毒,（3）按核酸的特性（polarity）或意义（sense）区分 正链RNA（ +RNA）：病毒基因组单链RNA可以作为mRNA，即具有翻译模板 的活性，即为正极性（正意）。 负链RNA（-RNA）：病毒基因组单链RNA的核苷酸系列与其mRNA互补，经病 毒粒携带的依赖于RNA的RNA多聚酶转录产生的m

22、RNA，即为负极性（负意） 双意RNA（ambisense RNA）：病毒基因组单链RNA部分为正意、部分为负 意。 正链DNA（+DNA）：病毒基因组单链DNA序列与其mRNA相 同。 负链DNA（-DNA）：病毒基因组单链DNA序列与其mDNA互补 dsRNA的转录链为负链，另一条链为正链。 dsDNA一般不以极性定义，但HBV，HPV dsDNA中，仅一条链被转录，则转录链为负链，另一条链为正链。,ssRNA,ssDNA,病毒核酸类型,二、病毒蛋白质,根据其是否存在于毒粒之中分为： 结构蛋白（structure protein）：构成一个形态成熟的有感染性的病毒颗粒所必需的蛋白质，是毒粒

23、的结构组成，包括壳体蛋白、包膜蛋白、毒粒酶（存在于病毒毒粒中的病毒酶） 。 非结构蛋白（non-structure protein, NS）：由病毒基因组编码的，在病毒复制过程中产生，并在病毒复制中具有一定的功能，但不结合于毒粒中的蛋白质。,（一）壳体蛋白,构成病毒壳体结构的蛋白质： 1、壳体蛋白的结构 由一条或多条肽链折叠形成，具有三级结构的蛋白质亚基是壳体蛋白构成的最小单位，许多亚基借助次级键或静电引力互相聚合形成具有四级结构的壳体。 2、壳体蛋白的功能 （1）构成病毒的壳体、保护病毒的核酸 （2）无包膜病毒的壳体蛋白参与病毒的吸附、进入、 决定病毒的亲嗜性。 （3）决定病毒抗原性 （4）

24、其他生物活性，如血凝活性、细胞毒性等。,（二）包膜蛋白,存在于病毒包膜中的病毒结构蛋白，是包膜的结构组成，包括： 包膜糖蛋白（envelope glycoprotein） 基质蛋白（matrix protein） 1、包膜糖蛋白 （1）包膜糖蛋白的结构 系由多肽骨架与寡糖侧链，通过 -N-糖苷键将N-乙酰葡萄糖胺与多肽链的门冬酰胺残基连接形成，分为膜外结构域（包膜突起）和跨膜结构域。,（）包膜糖蛋白类型 简单型（高甘露糖型）糖蛋白；由N-乙酰葡萄糖胺核心单位与重复的侧支甘露糖链构成 复合型糖蛋白：由N-乙酰葡萄糖胺核心单位和由半乳糖、岩藻糖、唾液酸及甘露糖等组成的侧支糖链构成。,（3）包膜糖蛋

25、白的功能 A、构成病毒的包膜，保护病毒的核壳结构 B、在病毒的吸附，进入过程中具有重要作用， C、病毒表面特异性抗原，决定病毒的抗原性。 D、其他生物活性，如血凝活性（流感病毒的HA糖蛋白），神经氨酸酶活性（流感病毒的NA糖蛋白），细胞融合活性（仙台病毒的糖蛋白）等。,2、基质蛋白 病毒包膜脂双分子层与核壳之间的亚膜结构（submembrane），一般为非糖基化蛋白。 功能： （1）支撑包膜、维系包膜结构； （2）在病毒包装时，在核壳与包膜糖蛋白的识别过程中发挥作用。,3、毒粒酶 参与病毒复制的酶来源于： （1）宿主细胞酶或经修饰、或结合了病毒组分而改变了宿主细胞酶。 （2）病毒的非结构蛋白

26、（3）存在于病毒毒粒的毒粒酶，系由病毒基因组编码，在病毒复制成熟过程中作为结构组分结合于毒粒内。,三、病毒的脂质,主要存在于病毒的包膜中，包括磷脂、脂肪酸、甘油三酸脂等，主要以磷脂形式存在，因病毒包膜系病毒以芽出方式成熟时由细胞膜衍生而来，故其脂质的种类和含量与宿主细胞膜相同，具有宿主特异性。,四、病毒的碳水化合物,主要存在于有包膜病毒中，以寡糖侧链形式与蛋白质结合形成包膜糖蛋白。 五、其他组成 多胺类有机阳离子（如丁二胺、亚精胺、精胺等） 无机阳离子（如Fe+、Ca+ 、Mg+ 、Cu+等） 系病毒成熟时从环境中获得的不恒定的组分。,第三节 毒粒的形态结构,一、毒粒的大小和形状 1、毒粒的大

27、小 不同的病毒差异很大 双粒病毒 直径 18-22nm 痘病毒 300-450nmX170-260nm,2、毒粒的形状 （1）球形颗粒 实际是拟球形颗粒，无包膜者常称做等轴颗粒（isometric particles） （2）杆状颗粒 刚直杆状 烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV） 弯曲杆状 马铃薯X病毒（Pototo virus X, PVX） 丝状 甜菜黄花病毒（Beet yellow virus, BYV） （3）复杂形状颗粒 如 Poxviruses , E.coli phage T4 （4）有些病毒颗粒呈多形性（pleomorphic）如Infuenze

28、viruses,二、毒粒的壳体结构,（一）病毒壳体构成的原理 1、物理学原因 （1）任何物质结构稳定的必要物理条件是必须处于自由能最低状态。 （2）蛋白亚基要装配成一个稳定的壳体结构必须彼此之间以最大数目的次级键结合，如此自由能才能充分释放，壳体处于自由能最低状态，结构方能趋于稳定。 （3）非对称的蛋白质亚基分子彼此之间欲以最大数目成键，必须对称排列形成高度有序的对称结构。,2、几何原理 对称结构形成： 园柱体对称： 病毒壳体呈螺旋对称 立方对称：包括正四面体、正六面体、正八面体、正十二面体和正二十面体、在这些拓朴等价多面体中，当表面积一定时，以二十面体容积最大。病毒壳体呈二十面体对称。 球对

29、称：构成病毒壳体的蛋白质亚基数量有限，故不可能采取球对称形式。,（二）螺旋对称壳体 （1）蛋白质亚基有规律地沿着螺旋的中心轴呈螺旋排列所形成的高度有序的，对称的稳定结构。 （2）描述螺旋对称壳体特征的参数：螺旋长度、螺旋直径、轴孔直径、螺矩、螺转数、构成螺旋壳体的蛋白质亚基总数，每一螺转的蛋白质的质亚基数。 （3）螺旋壳体的直径是由蛋白质亚基的特征所决定， （4）螺旋的长度是由与壳体结合的病毒核酸分子所决定 （5）病毒核酸分子与蛋白质亚基结合： *控制螺旋的形成 *增加壳体结构的稳定性,例： TMV 亚基总数 2130个 螺旋壳体长度 300nm 螺旋壳体直径 15-18nm 轴孔直径 4nm

30、 螺距 2.3nm 螺转数 130 每一螺转上亚基数 16 1/3 个,（三）二十面体对称壳体,1、二十面体的特点 二十面体是具有二十个三角面、三十条棱和十二个顶的立方体，正二十面体的三角面均为等边三角形（基本三角面），并且具有5次、3次和2次对称轴。 5次对称：以相对应的顶点的连线为轴，旋转72o，其型不变，旋转5次复位。 3次对称：以相对应的三角面中心的连线为轴，旋转120o ，其型不变，旋转3次复位。 2次对称：以相对应的棱的中心的连线为轴，旋转180o ，其型不变，旋转2次复位。,2、二十面体构成的方式 （1）蛋白质亚基严格等价结合构成正二十面体壳体。 Satellite tobacc

31、o necrosis virus (STNV)壳体由60个蛋白质基构成。 60 protein subunits12pentonsicosahadron capsid,(2)蛋白质亚基准等价结合构成二十面三角体壳体 A、构成更大、更为复杂的壳体须增加亚基数目 B、更多数目蛋白质亚基在扩大的二十面体中须 处于等价或准等价环境方能保持结构稳定 C、蛋白质亚基在扩大的二十面体的基本三角面被剖分成的若干个全等三角形（亚三角形）中对称排列。 D、二十面体三角体（icosadeltahedron）:基本三角面被剖分成的若干亚三角形的二十面体。 在二十面体三角体壳体中，二十面体壳体所有12个五邻体仍保留，但

32、有六邻体（hexon）在二十面体的基本三角面上形成。,3、描述二十面体壳体特征的结构参数 （1）三角剖分数（T）：二十面体的每个基本三角面被分割成的亚三角形数目。 T=pf2 ,f可取任何正整数（1，2，3）P为级数 （2）级数（P）：P=h2+hk+k2 ，h和k为无公因子的整数。 （3）蛋白质亚基数（Su）：Su=60T （4）壳粒数（C） ： C=10T+2 （5）五邻体数 ： 12 （6）六邻体数 ： 10（T-1）,（四）双对称（bisymemetry）壳体 有尾噬菌体（tailed phage）,三、病毒的包膜结构,（一）病毒包膜的来源 系病毒出芽出成熟时从细胞膜上获得的（除 Po

33、xviruses 外） 包括细胞质膜 大多数包膜病毒 高尔基体 Bunyavineses 核模 Herpesviruses 内质网膜 Spumaviruses,（二）病毒包膜的结构 脂双分子层 病毒包膜蛋白：包膜糖蛋白、基质蛋白（有些病毒，如 Togaviruses 无基质蛋白）,四、病毒毒粒结构的类型,1、无包膜的螺旋毒粒，以TMV为代表的多数植物病毒 2、无包膜的二十面体毒粒，如 Picornaviridae Adenoviridae , Reoviridae 3、有包膜的螺旋毒粒， 如 Orthomyxoviridae Paramyxoviridae, Bunyaviridae. 4、有

34、包膜的二十面体毒粒 ， 如 Togaviridae, Hepadnaviridae, Herpesviridae, Retroviridae 5、复杂毒粒 如 Poxviridae, Tailed phage,第四节 病毒的抗原性质,病毒毒粒及其构成中的各种蛋白质的组分，以及病毒在复制时产生的非结构蛋白都是具有免疫原性和免疫反应性的有效抗原。,一、病毒的抗原分类,1、根据病毒抗原是存在于毒粒中划分： 结构抗原 非结构抗原 2、根据结构抗原在毒粒中存在的部位划分 表面抗原 内部抗原 3、根据病毒抗原是否能诱导机体的抗病毒免疫保护划分： 保护性抗原（包括中和抗原） 非保护性抗原 4、根据病毒抗原的

35、特异性划分 科抗原（family Ags） 型特异性抗原（Type-specific Ags）,二、病毒特异性抗体,1、病毒特异性抗体 不同类型的病毒制毒物诱生的抗体种类有所不同 （1）以不能在宿主体内繁殖的病毒毒粒，或以无活性 的动物病毒毒粒免疫动物，主要产生抗病毒表面抗原的抗体； （2）以能在宿主动物体内繁殖的病毒毒粒免疫动物，可产生包括抗病毒表面抗原，内部抗原和非结构抗原在内的所有病毒抗原的抗体。 （3）以纯化的毒粒某一抗原组分进行免疫，仅能产生针对这一组分的抗体。,2、中和抗体 （1）中和抗体作用机理：中和抗体与病毒毒粒的抗体结合位点（或抗原决定簇）结合，可以抑制病毒吸附、进入、脱壳或

36、转录某一感染步骤，从而阻断病毒的复制，抑制病毒的感染。 （2）不同病毒的中和抗体的中和机理可能各有不同。 （3）同一病毒的不同类型的抗体的中和机理亦有不同。 （4）抗体可呈现协同作用，增加中和效应。,3、依赖抗体的增强作用（antibody dependment enhancement ） 在极少数情况下，病毒特异性抗体能增加病毒的感染，如黄热病毒（Yellow fever viruses ）登革热病毒（Dengue viruses） （1）发生抗体增强作用的条件 A、病毒能在单核巨噬细胞中增殖； B、机体在病毒感染之前已有对该病毒的非中和抗体或亚中和浓度的中和抗体存在。 （2）抗体增强作用的

37、机理 非中和抗体或亚中和浓度的中和抗体与病毒作用，形成病毒抗体复合物，因抗体的Fc段与单核巨噬细胞表面的Fc受体结合，从而大大增强了巨噬细胞被感染的机率。,三、病毒抗原的进化,1、抗原性漂移（antigen drift） 病毒在自然宿主内频繁传代所出现的抗原性微小的改变，一般认为它是在宿主免疫压力下，病毒突变体选择的结果。 2、抗原性转变（antigen shift） 病毒抗原突发的巨大改变，如甲型流感病毒（Influenzaviruses A）从H1N1亚型转为新的H2N2亚型，一般认为这是病毒基因重组的结果。 3、病毒抗原进化的原因 病毒的抗原进化是其编码基因突变累积的结果，在动物机体内生

38、态环境中进化的病毒受到中和抗体的抵抗，病毒的进化必然选择与中和作用有关的抗原决定簇的突变，而影响其它抗原位点的突变不会被选择出来。,第五章 病毒的复制,第一节 病毒的增殖性感染与复制周期 一、病毒的增殖性感染 1、感染是指病毒以毒粒作为载体将其遗传物质 传递给细胞，其中包括病毒吸附进入过程； 2、根据病毒是否能够感染进入细胞可分： 敏感细胞（sensitive cells）：病毒能够感染进入的细胞 非敏感细胞（non-sensitive cells）:病毒不能够感染进入的细胞,3、病毒进入细胞后并不一定能成功进行复制，产生有感染性的子代病毒，因此细胞还可据此分为： 允许细胞（permissiv

39、e cells）:病毒在其中能够复制的细胞 非允许细胞（non-permissive cells）:病毒在其中不能够复制的细胞 4、根据病毒感染后能否进行复制、繁殖产生子代病毒，可将其分为： 增殖性感染（productive infection） 非增殖性感染（non-productive infection）,二、一步生长试验（one step growth experiment）,1、概念：处于特殊培养的细胞被病毒同步感染，以致可由整个细胞群体所发生的病毒复制事件，推知单个细胞所发生的病毒复制事件。 2、方法： （1）以适量的病毒接种处于标准条件下培养的高浓度的敏感细胞（低感染复数感染，以

40、使一个细胞只被一个病毒感染） （2）待病毒吸附后，或是高倍稀释病毒细胞培养物，或是用抗病毒血清处理病毒细胞培养物（建立同步感染）。 （3）已处理的病毒细胞培养物继续置标准条件下培养。 （4）间时取样，测定培养物感染中心（infective center）的数目，即游离的有感染性的病毒颗粒数目和病毒感染的细胞数目。 （5）以感染时间为横座标，以病毒感染率为纵座标作图，得到病毒繁殖的一步生长曲线（one step growth curve),3、一步生长曲线：,由一步生长曲线可获得病毒复制的两个特征性数据 （1）潜伏期（latent period）:自病毒吸附于宿主细胞到受染细胞释放出子代病毒的最

41、短时间。 （2）裂解量（burst size）:每个受染细胞（infected cells）新产生的子代病毒的平均数目。由于一步生长试验的设计依据是：一个细胞仅被一个病毒感染。 故 裂解量=稳定期受染细胞所释放的全部病毒子代数目/潜伏期受染细胞数目 =稳定期感染中心数目/潜伏期感染中心的数目 =稳定期病毒效价/潜伏期病毒效价,三、病毒的复制周期 病毒复制周期：自病毒吸附于细胞开始，到子代病毒从受染细胞释放出来为止的病毒复制全过程。依其发生的病毒复制事件可为分下阶段： 1. 吸附 2. 进入和脱壳 3. 病毒生物大分子合成： 病毒基因组复制产生子代病毒基因组 病毒基因组表达产生病毒复制和包装所

42、需的蛋白质。 4. 装配与释放,第二节 病毒的吸附,一、吸附（attachment或adsorption）的概念： 病毒依赖其表面吸附蛋白与细胞受体的相互作用而固着于细胞表面。 二、病毒的吸附过程 1、初始吸附 2、粘附增加作用,三、病毒吸附蛋白（virus attachment protein, VAP） 病毒毒粒表面能够识别特异性的细胞受体，从而导致吸附反应发生的病毒结构蛋白。 如： E.coliphage T4 尾丝蛋白 Influenzaviruses HA糖蛋白 Paramyxoviruses HN糖蛋白 Adenoviruses 五邻体纤维,四、病毒的细胞受体（病毒受体） 1、病毒

43、受体：宿主基因组编码、控制表达的一组能与病毒相互识别和结合，以启动病毒感染的细胞膜表面的分子，其大多数蛋白质，亦可能为糖蛋白或磷脂。,2、病毒受体的性质 病毒受体分子并非为病毒感染特异性单独表达的，它们可能是细胞的特定受体，亦可能是特殊受体之外的膜蛋白分子。 （1）病毒受体数量的有限性。 （2）病毒受体细胞表面分布的不均匀性； （3）病毒受体的特异性。 A、细胞的种系特异性；决定了病毒的宿主范围。 B、组织特异性；决定了病毒的组织嗜性 C、病毒特异性；不同种类的病毒，具有不同的病毒受体。同种不同型的病毒，甚至同型病毒不同毒株亦可能有不同的病毒受体。,3、辅助受体（coreceptors）或第二

44、受体（secondary receptors） 在病毒与细胞表面的初始结合受体（primary binding receptors）结合后。某些病毒亦需与病毒辅助受体相互作用，才能导致病毒的吸附进入。这种在病毒与细胞初始结合后，能够结合毒粒及其发生变化了的形式的细胞表面分子称之为辅助受体或第二受体。 如：参与 HIV-1、HIV-2不同毒株感染的趋化因子受体 CCR5、CCR3、CCR8、CXCR4等，参与痘病毒吸附的 HveA 、 HveB 、HveC mediators.,第三节 病毒的进入与脱壳,一、病毒的进入 病毒吸附于细胞表面，能以不同的方式进入细胞。 动物病毒进入细胞的方式有：移位

45、、内吞、病毒包膜与细胞质膜融合、抗体依赖的增强作用等方式。,1、移位（translocation） 一些无包膜的二十面体病毒进入细胞的方式。在受体介导下发生，机制尚不明确，如Polioviruses. 2、内吞作用(endocytosis) （ 1） 不依赖pH机制：病毒进入过程在生理pH条件下进行。 A、病毒直接在细胞质膜进入（病毒包膜与细胞质膜融合） B、继病毒-受体复合物后，病毒从吞噬体（phagosome）装置内进入。（吞噬作用） （2）依赖pH机制 病毒-受体复合物进入酸性pH环境的内体（endosome）内，在病毒融合肽的介导下，病毒包膜与核内体膜融合，病毒进入。（受体介导的内吞）

46、,3、病毒包膜与细胞质膜融合,在生理pH条件下，病毒包膜糖蛋白（如Paramyxoviruses 的 F 糖蛋白，HIV的 gP120 糖蛋白）中的融合肽介导病毒包膜与细胞质膜融合，病毒进入细胞。根据膜融合通用模型（satalkny pothesis 基状假设） ，即基于膜的水合作用 、曲率 、张力的变化和半融合（semifusion）初反应，这些变化都有助于病毒的包膜与细胞质融合。,4、以抗体依赖的增强作用方式进入 病毒与亚中和浓度的病毒特异性抗体结合，所形成的病毒-抗体复合物可通过与细胞表面的免疫球蛋白受体的结合进入细胞。 通过 Fc 受体以抗体的增强作用的进入细胞的病毒有 Dengue

47、viruses 、 west Nile viruses 、 Influenza A viruses 和 HIV-1、HIV-2 等。,二、病毒的脱壳（uncoating） 病毒进入细胞后，必须经过脱壳，即除去蛋白质的外壳，释放出的病毒基因组方能进行复制和功能表达。但在目前为止，对于病毒脱壳的分子机理所知甚少。 1、 有些病毒，如脊髓灰质炎病毒（Polioviruses）的正链RNA基因组直接进入细胞质,而其他大多数病毒是以病毒核蛋白复合物（viral nucleoprotein complexes）形式进入细胞，以此形式进入细胞后都须经过一系列的去装配（disassembly）步骤进行脱壳。

48、2、病毒与宿主细胞受体结合后，病毒与受体多价的相互作用，可能引起病毒壳体蛋白的重排，必有助于病毒脱壳，释放病毒核酸。,3、病毒脱壳涉及蛋白水解酶，热裂解等因子的作用，此过程依赖于温度，大多数病毒脱壳的最适合温度是35-38。 4、利用毒粒携带的依赖于DNA的RNA多聚酶（DdRp）进行转录的DNA病毒、利用毒粒携带的依赖于RNA的RNA多聚酶（RdRp）进行转录的双链RNA病毒和负链RNA病毒、利用毒粒携带的逆转录酶（RdDp）进行复制的逆转录病毒，即具有非感染核酸的病毒都不完全脱壳，均以核蛋白体形式进入细胞 。双链RNA病毒、负链RNA病毒及逆转录病毒则称之为核糖核蛋白体（ribonucle

49、oprotein ， RNP）。如 Infuenzaviruses 的 RNP ，即由其负链RNA基因组、核蛋白（NP）和RdRp(包括PA、PB1、PB2)组成。,第五节 病毒大分子的合成,一、病毒大分子合成的基本过程 1、病毒基因组早期基因的表达（转录或 翻译） 2、病毒基因组的复制 3、病毒基因组晚期基因的表达（转录或翻译）,二、病毒大分子合成的控制,1、病毒大分子合成的空间分布 （1）RNA病毒：绝大多数RNA病毒在细胞质内复制，但亦有如 Influenzaviruses（须切割宿主细胞的mRNA的帽子结构为病毒基因组复制的引物），Retroviruses（须利用宿主细胞的 DdRp

50、II 进行转录）在细胞核内复制。 （2）DNA病毒：绝大多数DNA病毒在细胞核内复制，但有如 Poxviruses（利用毒粒酶 DdRp 进行转录）在细胞质内复制。,2、病毒大分子合成的时序性 病毒大分子的合成有强烈的时序性，这种时序性主要表现为基因组转录的时间组织（temporal organization），即大多数病毒的基因组是分早、晚期进行。 （1）早期转录：病毒核酸复制之前所进行的转录，早 期转录的基因为早期基因，转录产物为早期mRNA 。早期mRNA翻译产生早期蛋白，主要是参与晚期基因表达，病毒核酸复制，改变和抑制宿主细胞的大分子合成的非结构蛋白。 （2）晚期转录：病毒核酸复制开始

51、或复制后进行的转录，晚期转录的基因为晚期基因，转录产物为晚期mRNA 。晚期mRNA翻译产生晚期蛋白，主要是形成病毒毒粒的结构蛋白，以及参与病毒毒粒装配与释放的调控蛋白。,（3）有些病毒转录的时间组织更为复杂 如 E.coli phage T4 分为: 即早期(immediate early ， IE) 迟早期(delayed early DE) 中 期(middle ， M) ，亦称准晚期 (quasi-late) 晚 期(late ， L) Herpesviruses 分为: 即早期 (IE) 基因:包括0、4、22、27 等 早 期 (E) 基因:包括 1 、 2 等 晚 期（L) 基因

52、:包括 1 、 2 等 （4） 有些病毒基因的转录不表现时序性.,3. 病毒大分子合成与宿主细胞的适应。 （ 1）原核生物病毒（噬菌体）。 a. 原核生物病毒的基因为连续基因 b. 转录与翻译相互偶联 c. 一般不具有转录后的加工 d. 翻译可从mRNA内部起始，从而将一多顺反子的mRNA翻译成多个不同的功能蛋白质,（2）真核生物病毒 a. 真核病毒基因为割裂基因； b. 转录和翻译不相互偶联； c. 转录后的加工： mRNA 5末端加帽， mRNA 3末端聚腺苷化，mRNA转录后的拼接， mRNA甲基化。 d. 翻译一般不能从mRNA内部起始，真核病毒发展了不同的表达策略，以克服这一障碍。,

53、* 病毒基因组由数个核酸分子组成，分段基因组的每一个节段（除少数节段例外）均为单基因。 如 Reoviruses ， Orthomyxoviruses,* 以转录终止-再起始机制，将多顺反子的病毒基因组转录为多种不同的单顺反子mRNA 。如 Paramyxoviruse ， Rhabdoviruses.,* 转录产生多顺反子的初级转录本、经切割、拼接产生单顺反子的mRNA，包括大多数DNA病毒和某些RNA病毒，如Retroviruses。,* 病毒的整个RNA基因组（如Picornaviruses）或部分RNA基因组（如Togaviruses ， Coronaviruses），直接翻译成为一聚

54、蛋白前体，再经蛋白酶水解切割产生不同的功能蛋白质。,3、RNA病毒的复制,（1）RNA病毒基因组的复制和mRNA合成策略,（2）病毒的依赖于RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp） 1960年在Polioviruses和Mengoviruses的研究中发现依赖于RNA的RNA聚合酶。 A、病毒的RNA聚合酶通常为由几个病毒基因产物构成的多亚单位装配物，如Influenzavmses的RdRp由PA,PB1,PB2组成。 B、按照在感染中的活性，病毒的RdRp可分为： 复制酶：从病毒RNA复制产生子代基因组 转录酶：从病毒RNA转录产生mRNA

55、。 C、病毒的RdRp缺乏校读活性，故病毒RNA复制的碱基错配率很高（高于DNA复制的10,000倍以上），这亦是RNA病毒频于变异的原因。,（3）病毒的逆转录酶（retrotranscriptase, RT） 1970年，Baltimore和Temin分别在劳斯肉瘤病毒（Rous sarcoma viruses）和禽白血病病毒（Avian leucosis viruses）的研究中发现逆转录酶。 A、逆转录酶具有四种酶活性： 依赖于RNA的DNA多聚酶（RdRp）活性。 依赖于DNA的DNA多聚酶（DdDp） 解旋酶活性 RNaseH活性 B、逆转录酶在以RNA作为模板进行DNA合成的过程中

56、（RdDp活性）亦缺乏校读活性，故在在复制过程中有逆转录阶段的RNA病毒（Retroviruses）和DNA病毒（Hepadnaviruses）突变率高，频于变异。,（4）RNA病毒的转录 A、转录方式的转录：产生不完全转录本，作为mRNA。 B、复制方式转录：产生完全转录本，作为子代链或子代链合成的模板。,（5）RNA病毒的翻译 A、5端有帽子结构的正链RNA病毒的基因组RNA，负链RNA病毒和双链RNA病毒的mRNA，以依赖于5帽子的扫描机制进行翻译。 B、5端无帽子结构的正链RNA病毒（如Picornaviruses）以内部核糖体结合机制进行翻译。 内部核糖体进入位点（Internal

57、ribosome entry site, IRES）,RNA病毒的转录策略,4、DNA病毒的复制,(1)痘病毒（如Poxviruses）的复制示意图,（2）疱疹病毒（如Herpesviruses）的复制示意图,（3）嗜肝DNA病毒（如Hepadnaviruses）复制示意图,（4）多瘤病毒（如Polyomaviruses）复制示意图,第五节 病毒的装配与释放,一、病毒的装配1、自我装配(self assembly)病毒的壳体蛋白亚基以结晶作用的方式自发地装配成病毒壳体.2、指导装配（directive assembly）有病毒基因组编码的某些非结构蛋白，即形态发生因子（morphogentie

58、 factor）是与分子病毒，壳体装配。 形态发生因子的功能： （1）脚手架蛋白（scaffolding protein）,在病毒壳体过程中具有瞬时功能，但是不结合入病毒体结构中，一旦病毒壳体装配成熟，脚本架蛋白便从病毒壳体中除去，或是被水解，或是与下一轮病毒壳体装配。 （2）蛋白质水解切割，在大多数噬菌体或动物病毒装配过程 ，毒粒的成往往需要在前头部（prehead）或前毒粒（previrion）形成后，对其中较大的前体蛋白的进行切割加工。,3、病毒的包装层号（packacing single） 病毒基因组能与壳体蛋白相通过识别、结合起始包装的顺式作用元件。 如Retroviruses Hepatitis Bvirus(HBV)序列 4、病毒的包装容量 对于具二十面体壳体的病毒而言由于形成空壳（empty capsid）后再进行核核酸的包装，所以存在包装容量的限制。如Ademoviruses的壳体所能包装DNA的容量不能超过基因组长