生物化学-第二章-蛋白质化学2

1、第一节 概述 第二节 蛋白质的基本结构单位氨基酸 第三节 蛋白质一级结构与功能 第四节 蛋白质的空间结构与功能 第五节 蛋白质的重要理化性质 第六节 蛋白质相对分子质量的测定,蛋白质结构的主要层次,一级结构,四级结构,二级结构,三级结构,primary structure,secondary structure,Tertiary structure,quariernary structure,构象是分子内所有原子或原子团的空间排布所形成的一种立体结构，有机分子中单键的旋转就从一种构象变成另一种构象。 天然蛋白质分子都有与其生物活性相关的一种或少数几种构象。 稳定蛋白质三维结构的作用力：次级键（

2、主要）和共价二硫键。,一、维系蛋白质三维结构的作用力,维持蛋白质分子构象的作用力a.离子键 b.氢键 c.疏水键 d.范得华力 e.二硫键,二、蛋白质的二级结构,蛋白质的二级结构（secondary structure）指肽链主链不同区段通过自身的相互作用，形成氢键，沿某一主轴盘旋折叠而形成的局部空间结构，并不涉及氨基酸残基侧链的构象。是蛋白质结构的构象单元。,主要的维系键： 氢键,多肽链的主链可看成是由被C隔开的许多平面组成的。,一个天然蛋白质多肽链在一定条件下只有一种或很少几种构象，而且相当稳定。,由于C=O双键中的电子云与N原子上的未共用电子对发生“电子共振”，使肽键具有部分双键的性质，

3、不能自由旋转。,（一）多肽主链折叠的空间限制,组成肽键的原子处于同一平面。,其中H和O原子处于C-N键的两侧，形成反式。,在大多数情况下，以反式结构存在。,肽键平面由于肽键具有部分双键的性质，使参与肽键构成的六个原子被束缚在同一平面上，这一平面称为肽键平面、肽平面或酰胺平面。,酰胺平面,-碳原子与其他原子之间均形成单键，因此两相邻的肽键平面可以作相对旋转。,N-C 旋转角,C -C旋转角,这些键可转动,肽平面,肽键不能转动,多肽主链的酰胺平面结构形式,C -C旋转角,N-C 旋转角,酰胺平面与-碳原子的二面角（ 和 ）,酰胺平面,二面角 两相邻酰胺平面之间，能以共同的C为定点而旋转，绕C-N键

4、旋转的角度称角，绕C-C键旋转的角度称角。和称作二面角，亦称构象角。,完全伸展的多肽主链构象,-碳原子,酰胺平面,=1800，=1800,酰胺平面,=00，=00,侧链,非键合原子接触半径,=00，=00的多肽主链构象(并不存在),（二）蛋白质二级结构主要类型,1、 螺旋（helix） 2、 折叠（-pleated sheet） 3、 转角（-turn） 4、 无规则卷曲（nonregular coil）,1. 螺旋（-helix）,-螺旋是多肽链的主链原子沿一中心轴盘绕所形成的有规律的螺旋构象。,结构特征： 为一右手螺旋，侧链伸向螺旋外侧； 螺旋每圈包含3.6个氨基酸残基,螺距 0.54nm

5、，两个氨基酸之间的距离0.15nm； 螺旋以氢键维系（肽键上C=O氧与它后面（C端）第四个残基上的N-H氢间形成氢键），氢键方向与螺旋轴基本平行。,中心轴,33+4=13,-螺旋可表示为3.613,用SN表示： S代表每圈螺旋的 氨基酸个数， N表示氢键封闭环 本身的原子数。,R侧链对螺旋的影响, 多肽链上连续出现带同种电荷基团的氨基酸残基，（如Lys，或Asp，或Glu），不能形成稳定的螺旋。如多聚Lys、多聚Glu。 Gly在肽中连续存在时，不易形成螺旋。 R基大（如Ile）不易形成螺旋 Pro、羟脯氨酸中止螺旋。 R基较小，且不带电荷的氨基酸利于螺旋的形成。如多聚丙氨酸在pH7的水溶液中

6、自发卷曲成螺旋。,2. 折迭（-pleated sheet）,-折叠是由两条或多条肽链(或肽段)充分伸展成锯齿状折迭构象，侧向聚集，按肽链长轴方向平行排列形成的扇面状片层构象。,结构特征： 由若干条肽段或肽链平行或反平行排列组成片状结构； 主链骨架伸展呈锯齿状；-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，并交替地伸向平面二侧； 涉及的肽段较短，一般为510个氨基酸残基； 靠相邻肽链主链亚氨基N-H和羰基C=O氧之间形成的氢键维系。,-折叠包括平行式和反平行式两种类型,所有肽链的N-端都在同一边,相邻两条肽链的方向相反,平行式,反平行式,=-1190，=+1130,=

7、-1390，=+1350,从能量角度考虑， 反平行式更稳定。,3.转角（-turn）,也称-回折、弯曲或发夹结构，由四个连续的残基组成，第一个残基C=O与第四个残基N-H之间形成氢键，肽键回折180。这类结构主要存在于球状蛋白质分子表面。,Gly、Pro常存在,肽段有更大的任意性。 受氨基酸残基侧链的影响较大，经常是构成酶活性部位和其它蛋白质特异的功能部位。,又称自由卷曲，多肽主链不规则，多向性地随机盘曲所形成的构象。,常见于球状蛋白质分子中，在其它类型 二级结构肽段之间起活节作用，有利于 整条肽链盘曲折叠。,细胞色素C的三级结构,4. 无规则卷曲,（三）纤维状蛋白质,蛋白质外形呈纤维状或细棒

8、状，分子轴比（长轴短轴）大于10（小于10的为球状蛋白质）。 纤维状蛋白质是结构蛋白,含大量的-螺旋，-折叠片，整个分子呈纤维状，广泛分布于脊椎和无脊椎动物体内，起支架和保护作用。 角蛋白来源于外胚层细胞，包括皮肤以及皮肤的衍生物：发、毛、鳞、羽、甲、蹄、角、爪、啄等。角蛋白可分为-角蛋白和-角蛋白。,三股右手-螺旋向左缠绕形成原纤维，原纤维排列成“9+2”的电缆式结构称微纤维，成百根微纤维结合成大纤维,主要由-螺旋结构组成,1.-角蛋白(毛发蛋白),2005-9-16,卷发(烫发)的生物化学基础,角蛋白-螺旋间以S-S连接增加稳定性，硬角蛋白（甲、角等）比软角蛋白（毛发）有更多二硫键。,烫发

9、过程,丝心蛋白：具有高的抗张强度、柔软、有一定的伸展度。,2. -角蛋白(丝心蛋白）,-(Gly-Ser-Gly-Ala-Gly-Ala)n-,重复单元：,3. 胶原蛋白,胶原组织的基本成分（键，软骨，骨，牙齿，皮肤，血管） 重复单元：Gly-X-Pro（Gly-X-HyPro） 三股左手螺旋形成一右手超螺旋,(四）蛋白质的超二级结构,由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体，称为蛋白质的超二级结构。三种基本的组合形式： ；。,超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域。, ,三、蛋白质的三级结构,多肽链在二级结构或超

10、二级结构的基础上形成三级结构的局部折叠区，它是相对独立的三维球状实体，称为结构域（domain) 。,1.结构域,对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域。 对于较大的蛋白质分子或亚基，三级结构往往由两个或多个结构域缔合而成，即这些蛋白为多结构域。 结构域一般由100-200个氨基酸残基组成，但大小范围可40-400残基。 结构域之间常形成裂隙，酶的活性中心往往位于两个结构域之间。 结构域之间由“铰链区”相连，使分子构象有一定的柔性，通过结构域之间的相对运动，使蛋白质分子实现一定的生物功能。,卵清溶菌酶的三级结构中的两个结构域,-螺旋,-转角,-折叠,二硫键,结构域1,

11、结构域2,活性中心,全-结构,全 -结构,Bacterial ribonucleases,mammalian pancreatic ribonuclease,Thymidylate synthase,Lysozyme,Zinc Metallo-proteases,Serine protease inhibitor,， -结构,三级结构（tertiary structure）：多肽链在二级结构、超二级结构和结构域的基础上，主链构象和侧链构象相互作用，进一步盘曲折叠形成球状分子结构。三级结构是多肽链中所有原子的空间排布。,2.三级结构,肌红蛋白由一条多肽链盘绕成 一个外圆中空的不对称结构,血红素存

12、在于分子 表面疏水性裂缝中,含有多种二级结构单元； 蛋白质的三级结构具有明显的折叠层次； 三级结构构象近似球状或椭球状； 分子中大多数非极性侧链埋在分子内部，而极性侧链在分子表面（疏水核、亲水面） ； 分子表面往往有一个内陷的空隙，它常常是蛋白质的活性中心。,球状蛋白质三级结构特征：,三级结构构象的稳定主要靠疏水相互作用维系，二硫键、离子键、范德华力等也起一定的作用； 三级结构形成后，蛋白质分子的生物活性部位即形成。,具有一条肽链的蛋白质分子只有三级结构，无四级结构。,四、蛋白质的四级结构,四级结构（quaternary structure）：由两个或两个以上的三级结构的球状蛋白质通过非共价键

13、聚合而成，有特定三维结构的蛋白质构象。 每个球状蛋白质称为亚基(subunit) 。 由两个或多个亚基组成的蛋白质统称寡聚蛋白或多体蛋白质（multimeric protein).,血红蛋白,蛋白质四级结构的特点：,有多个亚基； 维持亚基之间的化学键主要是疏水相互作用，其次是氢键、二硫键、盐键、范德华引力等; 亚基单独存在时无生物活性或活性很小，只有通过亚基相互聚合成四级结构后，蛋白质才具有完整的生物活性； 亚基间具有协同性和别构效应。,血红蛋白（Hb）结构示意图,氨基酸 顺序,多肽链 （单体蛋白或亚基）,寡聚蛋白,-螺旋,一级结构,二级结构,三级结构,四级结构,血红蛋白是由四个亚基组成，2个

14、-亚基，2个-亚基，每个亚基由一条多肽链与一个血红素辅基组成 。个亚基以正四面体的方式排列，彼此之间以非共价键相连（主要是离子键、氢键） 。,血红蛋白的四级结构,血红蛋白的变构效应和输氧功能,血红蛋白的结构,五、蛋白质高级结构与功能的关系,血红素结构,四个与血红素的吡咯环的N结合； 一个与肽链分子中的组氨酸咪唑基的氮原子相连； 空着的一个配位键可与O2可逆地结合，结合物称氧合血红蛋白（HbO2）。,血红素的铁原子共有6个配位键,血红素与氧结合后，铁原子半径变小，就能进入卟啉环的小孔中，继而引起肽链位置的变动。,血红蛋白输氧功能和构象变化,协同效应(cooperativity),具有协同变构性质

15、的蛋白质称为变构蛋白。,一个寡聚体蛋白质的一个亚基与其配体结合后，能影响此寡聚体中另一个亚基与配体结合能力的现象，称为协同效应。 如果是促进作用则称为正协同效应 (positive cooperativity) 如果是抑制作用则称为负协同效应 (negative cooperativity),煤气中毒的机制,一氧化碳（CO）也能与血红素Fe原子结合。由于CO与血红蛋白结合的能力是O2的200倍，因此，人体吸入少量的CO即可完全抑制血红蛋白与O2的结合，从而造成缺氧死亡。 急救方法是尽快将病人转移到富含O2的环境中（如新鲜空气、纯氧气或高压氧气），使与血红素结合的CO被O2置换出来。,第一节 概

16、述 第二节 蛋白质的基本结构单位氨基酸 第三节 蛋白质一级结构与功能 第四节 蛋白质的空间结构与功能 第五节 蛋白质的重要理化性质 第六节 蛋白质相对分子质量的测定,第五节蛋白质的重要理化性质,一、蛋白质胶体性质 二、两性解离性质及等电点 三、蛋白质的变性与复性 四、蛋白质的沉淀 五、蛋白质呈色反应 六、蛋白质的紫外吸收特性 七、蛋白质的免疫学性质,一、蛋白质胶体性质,蛋白质属于生物大分子之一，分子量可自5000至100万，在水溶液中形成1-100nm的颗粒，因而具有胶体溶液的特征（布郎运动、丁道尔现象、不能透过半透膜）。,真溶液 （溶质颗粒直径小于1nm）,悬浊液 （溶质颗粒直径大于100n

17、m）,胶体溶液 （溶质颗粒直径在1100nm之间）,蛋白质胶体稳定的因素： 表面电荷：蛋白质在非等电点状态时，分子表面带同种电荷，又吸附溶液中异性电荷，形成双电层； 水化膜：可溶性蛋白质分子表面分布着大量极性氨基酸残基，对水有很高的亲和性，通过水合作用在蛋白质颗粒外面形成一层水化层，可防止分子互碰而聚集。,酸性溶液,碱性溶液,透析法：利用蛋白质不能透过半透膜的性质，将含有小分子杂质的蛋白质溶液放入透析袋再置于流水中，小分子杂质被透析出，大分子蛋白质留在袋中，以达到纯化蛋白质的目的。是一种膜过滤技术。,蛋白质胶体性质的应用,超滤：一种加压的膜过滤技术，在液压作用下，迫使小分子物质透过膜，大分子则

18、被阻止在膜内侧，从而过到分离纯化的目的。,二、蛋白质两性解离性质和等电点,蛋白质分子除两端的氨基和羧基可解离外，氨基酸残基侧链中某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。,蛋白质的两性电离,当蛋白质溶液在某一定pH值时，使某特定蛋白质分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该蛋白质的等电点 （isoelectric point，pI）。,蛋白质在纯水溶液中的带电状态没有其它离子干扰，完全由H+的解离和结合来决定，这种条件下的等电点称为等离子点。,蛋白质的等离子点（特征常数）：,蛋白质的等电点不是一成不变的，它随溶剂性质

19、、离子强变等因素而改变。,等电沉淀技术：利用蛋白质在等电点pH条件下，蛋白质为电中性，易发生絮结沉淀这种性质进行分离制备。 蛋白质电泳：利用蛋白质在溶液pH值不等于等电点的条件下带电的性质，在直流电场中向其所带电荷相反电极移动的性质，将不同带电性质的蛋白质进行电泳分离技术。,蛋白质两性解离性质的应用,三、蛋白质变性与复性,1.蛋白质变性（denaturation）： 蛋白质在某些物理和化学因素作用下，其特定的空间构象被破坏，即有序的空间结构变成无序的空间结构，从而导致其理化性质和生物学功能都随之改变或丧失。,变性的本质,破坏次级键，不改变蛋白质的一级结构。,造成变性的因素 如加热、乙醇等有机溶

20、剂、强酸、强碱、表面活性剂（如十二烷基硫酸钠即SDS）、还原性试剂（尿素、盐酸胍）、紫外线、机械力等。,变性蛋白质的性质改变： 物理性质：旋光性改变，溶解度下降，沉降率升高，粘度升高，光吸收度增加等； 化学性质：侧链基团反应性增加，易被蛋白酶水解。 生物学性质：原有生物活性丧失，如酶失去催化活性、抗体失去免疫活性等。,理化因素,次级键 断裂,空间结构 遭破坏,理化性质改变,生物学活性丧失,溶解度下降 易被酶水解 粘滞度增加,酶失去催化活性 激素失去调节功能 Ag-Ab失去免疫原性,变性原因,变性本质,变性结果,蛋白质变性,应用举例 研究蛋白质分子结构与功能需要将蛋白质变性。 食品加工、消毒灭菌

21、、蚕茧抽丝等都需要引起蛋白变性。 防止蛋白质变性也是有效保存蛋白质制剂（如酶制剂、疫苗等）的必要条件。,2.蛋白质复性（renaturation）：,蛋白质的变性作用如果不过于剧烈，则是一种可逆过程，变性蛋白质通常在除去变性因素后，可缓慢地重新自发折叠成原来的构象，恢复或部分恢复原有的理化性质和生物活性，这种现象成为复性。,核糖核酸酶变性与复性作用,Native ribonuclease,Denative reduced ribonuclease,Native ribonuclease,变性,复性,有催化活性,非折叠状态，无活性,四、蛋白质的沉淀,如果加入适当的试剂使蛋白质分子处于等电点状态或

22、失去水化层（消除相同电荷，除去水化膜），蛋白质胶体溶液就不再稳定并将产生沉淀(不变性沉淀、变性沉淀)。,可逆沉淀,（变性沉淀）,结构、性质不改变,结构、性质发生改变,（等电点、盐析、有机溶剂）,（加热、强酸、强碱、重金属盐、生物碱试剂）,（非变性沉淀）,不可逆沉淀,水化层,蛋白质胶体溶液沉淀作用示意图,沉淀类型 A.可逆沉淀/不变性沉淀 在发生沉淀反应时，蛋白质虽已沉淀析出，但它的分子内部、空间结构并未发生显著变化，基本上保持原有的性质，沉淀因素除去后，能再溶于溶液中。这种作用称为可逆沉淀反应。 大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质以及利用等电点的沉淀提纯蛋白质时

23、，常利用可逆沉淀反应。,盐析：在蛋白质溶液中加入高浓度的硫酸铵、氯化钠等中性盐，使蛋白质沉淀析出的现象。（破坏蛋白质颗粒的水化层，同时又中和了蛋白质表面的电荷。） 盐溶：在盐浓度很稀的范围内，随着盐浓度增加蛋白质的溶解度随之增加，这种现象为盐溶。（蛋白质表面电荷吸附盐离子后，增强了蛋白质和水的亲和力。） 分级盐析：同一溶液不同相对分子质量的蛋白质，可通过逐步提高盐浓度的方法逐一沉淀分离出来。（相对分子质量大的容易盐析，相对分子质量越小，所需盐浓度越高。）,B.不可逆沉淀/变性沉淀 在发生沉淀反应时，蛋白质分子内部结构、空间构象遭到破坏，失去原来的天然性质，这时蛋白质已发生变性，这种变性蛋白质的

24、沉淀不能再溶解于原来溶剂或水溶液中。这种作用称为不可逆沉淀反应或变性沉淀。 重金属盐、生物碱试剂，强酸、强碱、加热、震荡、超声波、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。,蛋白质变性、沉淀、凝固之间的关系 蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在而并不析出，例如：在强酸碱中变性的蛋白质在强酸碱溶液中仍存在电荷效应，所以不表现为沉淀现象。 沉淀的蛋白质也未必都已变性。 加热使蛋白质变性并凝聚成块状称为凝固。因此，凡凝固的蛋白质一定发生变性。,变性Pro不一定沉淀 沉淀Pro不一定变性 变性Pro不一定凝固 凝固的Pro一定变性,五、蛋白质主要呈色反应,双缩脲反应 酚试剂反应 蛋白质定量

25、、定性 茚三酮反应 测定常用方法,双缩脲反应,蛋白质和两个肽键以上的多肽化合物都具有双缩脲反应。,粉红色络合物,(碱性溶液),Cu2+,双缩脲,尿素,与茚三酮反应,脯氨酸产生黄色物质，其它为蓝紫色，在540nm（蓝紫色）或440nm（黄色）定量测定。,脱氨脱羧反应,酪氨酸与福林-酚试剂反应,六、蛋白质的紫外吸收特性,由于蛋白质分子中含有共轭双键的酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸，因此在280nm波长处有特征性吸收峰。蛋白质的OD280与其浓度呈正比关系，因此可作蛋白质定量测定。,测定范围：0.10.5mg/ml,第一节 概述 第二节 蛋白质的基本结构单位氨基酸 第三节 蛋白质一级结构与功能 第四节 蛋

26、白质的高级结构与功能 第五节 蛋白质的重要理化性质 第六节 蛋白质相对分子质量的测定,第六节 蛋白质相对分子质量的测定,化学测定法 超离心沉降速度法 凝胶过滤法 SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳法,一、化学测定法,根据化学成分测定最小相对分子质量： 利用化学分析定量测定蛋白质中某一特殊元素的含量，并假定蛋白质分子中含1个这种元素，即可测算最低Mr。 如：用化学分析法测定血红蛋白质中含Fe 0.34，则最低 Mr=55.84100/0.34=16700； 用其它方法测定，其实际M为16700的4倍，由此可知，血红蛋白含有4个Fe的原子，而不是1个Fe。,二、超离心沉降速度法,既可以用来分离纯化

27、蛋白质也可以用作测定蛋白质的分子量。,对蛋白质溶液进行6000080000r/min的高速离心，蛋白质分子会向离心池底部方向移动，离心池上面成为清液，清液与下面的溶液之间出现一个界面，用光学方法测定界面移动的速度，即为蛋白质的离心沉降速度。,蛋白质的离心沉降速度用沉降系数(sedimentation coefficient, S)表示。 物理意义：溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，量纲为秒，一个S单位是110-13s。 沉降系数S与蛋白质的分子大小和形状相关。相对分子质量越大，S值越大。 蛋白质的沉降系数：1200S。,因为沉降系数S大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量

28、，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。,凝胶过滤：又称分子筛层析，利用各蛋白质分子大小不同而分离，也是测定蛋白质相对分子质量常用的方法之一。 此法对变性蛋白和线性分子不适用。,三、凝胶过滤法,凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构。 一定型号的凝胶网孔大小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外。,洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大。 测定蛋白质分子量一般用葡聚糖凝胶，商品名：Sephadex 洗脱体积：自加入样品开始到该组分的洗脱峰峰顶（即收集液中该组分浓度最大时）出

29、现时所流出的洗脱液体积。,测得几种标准蛋白质的洗脱体积Ve； 以相对分子质量对数（logMr）对Ve作图，得标准曲线； 同样条件下测得未知样品洗脱体积。 从标准曲线上查出样品蛋白质相对分子质量。,测定样品蛋白质分子量的方法：,聚丙烯酰胺凝胶：单体丙烯酰胺（acrylamide,简称Acr）和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺（methylene-bisacrylamide,简称Bis）在加速剂和催化剂的作用下聚合而成的高分子物质，具有三维网状结构和分子筛性质。以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis, 简称PAGE）。 SDS

30、:十二烷基硫酸钠，变性剂,四、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 常用于蛋白质分子量的测定,用SDS处理蛋白质，蛋白质变性，结合大量SDS，带上大量的负电荷，且荷质比相同（蛋白质分子大，结合SDS多；蛋白质分子小，结合SDS少），荷质比对不同分子量的SDS蛋白质的电泳迁移率的影响没有差别。 普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、大小、形状）。 迁移率主要取决于凝胶对长短不同棒形分子产生的不同阻力。分子小，电泳受阻小、迁移率大；相对分子量大，迁移率小。 此方法只能测得单体蛋白或亚基肽链的相对分子质量。,几种已知分子量标准蛋白的相对迁移率与相对分子量的对数作标准曲线。 根据未知分子相对迁移率查相对

31、分子质量。,方法：,PAGE,电泳结果,沉淀法,盐析法 有机溶剂沉淀法,层析法,离子交换层析 吸附层析 凝胶过滤（分子筛） 亲和层析。,电学法,蛋白质分离纯化方法,透析法,电泳,预处理,粗分离,纯化,生物组织,无细胞提取液,破碎、溶 解、差速离心,选择性沉淀法,亲和 层析,离子交换层析,精制后的蛋白质,凝胶 过滤,疏水 层析,吸附层析,选择性沉淀法（盐析、等点沉淀、有机溶剂沉淀等）,蛋白质分离纯化,（1）根据分子大小不同的分离方法,透析法,利用蛋白质 分子不能透 过半透膜的 方法。,超滤法：利用压力或离心力强行使水和小分子杂质通过超滤膜（一种半透膜）除去，而蛋白质留在膜上。,离心沉降法,利用分子量不同的方法。,凝胶过滤法（分子筛色谱）,分子筛层析,（2）利用溶解度不同的分离方法,等电点沉淀法,盐析法,分段盐析：利用不同的蛋白质所带电荷、水化程度 不同，所需盐浓度不同分离。,血浆清蛋白,血浆球蛋白,饱 和 （NH4）2SO4,半 饱 和 （NH4）2SO4,有机溶剂沉淀法,离子交换色谱,（3）根据电离性质不同的分离方法,离子交换色谱法,90,醋酸纤维素薄膜电泳,电泳法,（4）根据吸附性质不同的