免疫学技术研究生

1、第十四章 免疫学检测技术,经典的免疫学方法： 一、凝集反应（agglutination） 细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结 合后形成凝集团块的反应。 1、直接凝集反应 2、间接凝集反应 3、间接凝集抑制反应,二、沉淀反应（precipitation） 血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶 性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物的反应。 1、单向免疫扩散（single immunodiffusion） 2、双向免疫扩散（double immunodiffusion） 3、免疫电泳（immunoelectrophoresis） 4、火箭免疫电泳（rocket immunoelectrophores

2、is） 5、免疫浊度测定（immunonephelometry）,免疫浊度测定： 可溶性Ag+Ab，二者比例合适时，在特殊的缓冲 液中快速形成一定的AgAb复合物，使反应液出 现浊度。 透射比浊法 散射比浊法 速率散射比浊法 终点散射比浊法,一定要保持抗体过量，以维持抗原抗体复合物的相 对不溶解性。,该方法的分析范围主要检测的是血浆、体液 中特定蛋白系列。如Ig、补体、血浆蛋白、 炎性反应蛋白、一些小分子量的治疗性药物 浓度等。,第一节 免疫学检测常用标记技术,免疫标记技术（immunolabelling technique） 指用荧光素、放射性核素、酶、发光剂或电 子致密物质（胶体金、铁蛋白

3、）作为示踪剂标 记抗体或抗原进行的抗原抗体反应。 优点：高灵敏度、特异性、快速，能定性、定量、定位测定，易于观察结果并适合自动化检测。 总体分为：免疫组化：定位检测组织或细胞中的 Ag/Ab 免疫测定：定量检测液体标本中的 Ag/Ab 也可分为：荧光免疫技术，放射免疫技术，酶免疫技术，化学发光免疫技术及免疫金标记技术等。,一、酶免疫技术 基本原理：以酶标记抗体（或抗原）用于免疫检 测，通过相应底物被酶解后的显色反应，对标本中的抗原/抗体进行定量、定位分析。 标记物：酶（催化底物：生物放大作用） 特点：灵敏度高、特异性强、准确性好，酶标记试剂能够较长时间保持稳定，检测方法简便安全易行，容易与其他

4、技术偶联衍生出适用范围更广的新方法。,（一）常用的酶和酶作用底物 1、辣根过氧化物酶（HRP） HRP来源于植物辣根中，分子量40KD，由主酶 （糖蛋白）和辅基（亚铁血红素）组成的复合物。 HRP常用的底物有： （1）邻苯二胺（OPD）OPD显色后为橙黄色，加入终止液为棕黄色，可溶性产物，应用最早，但配成溶液后稳定性差，且有潜在的致癌性，显色反应需避光。 （2）四甲基联苯胺（TMB） TMB经酶作用呈兰色，可溶性产物，加酸终止后黄色，稳定性好，显色反应无需避光，无致突变作用。应用最广泛。但水溶性差。,2、碱性磷酸酶（AP） AP从大肠杆菌或小牛肠粘膜中提取，菌源性活力小于小肠粘膜活力。AP价格

5、较HRP高，稳定性差，但敏感度高，空白值低。 可催化对硝基苯磷酸酯（p-NPP），生成黄色的对硝基酚，NaOH终止后黄色可稳定存在一段时间（405nm）。,（二）酶免疫技术的分类 酶免疫组化 （EIH） 均相酶免疫测定（HEI） 酶免疫测定 非均相酶免疫测定 固相酶免疫测定 （EIA） 液相酶免疫测定 （同RIA）,（三）酶免疫测定（EIA） 1、均相酶免疫测定（HEI）,特点：仅需将待测样品、酶标试剂和底物溶液混合，待抗原抗体反应完成即可直接测定结果，整个检测过程都在均匀的液相中进行。 以酶放大免疫测定技术（EMIT）为例：,2、非均相酶免疫测定,（1）液相酶免疫测定（液相EIA）： 同RI

6、A：抗原、酶标抗原、抗体相继加入后，使反应达到平衡，再加分离剂。 （2）固相酶免疫测定（固相EIA）： AgAb反应在固相载体的表面进行，应用最广泛的是酶联免疫吸附试验（ Enzyme linked immunosorbent assay ELISA ）,1） ELISA 基本原理 将抗原或抗体结合到固相载体的表面，并保持其免疫活性。 抗原或抗体与酶连接成酶标抗原或抗体，仍分别保持其免疫活性和酶活性。 在固相载体上按照一定的步骤加入待测抗原或抗体及酶标抗体或酶标抗原，洗去未结合的游离物质，加入酶的底物显色，颜色的深浅与待测物质含量呈相关性。,2）固相载体的种类 A、塑料制品 聚苯乙烯： 蛋白质

7、非共价键或物理吸附结合到载体表面，可制成小试管、小珠、微量反应板的形式专用于ELISA的微量反应板ELISA板（812=96孔） B、微颗粒 高分子单体聚合成的微球或颗粒，带有能与蛋白质结合的功能基团，易于化学偶联，结合容量大。反应时可均匀的分散到整个反应溶液中，反应速度快。其中可包裹磁性物质，制成磁化微颗粒，使分离可在磁板中完成，自动化分析。 C、膜载体 NC膜（硝酸纤维素膜） 、玻璃纤维素膜、尼龙膜等微孔滤膜。非共价键吸附Ab/Ag，吸附能力强。广泛应用于斑点-ELISA等。,3）ELISA方法类型及反应原理 A、双抗体夹心法 此法是检测大分子抗原的常用方法。,上述方法亦可改为双位点一步法

8、，使用针对抗原分子上两个不同表位的单克隆抗体，分别作为固相抗体和酶标抗体。注意钩状效应。,B、间接法 此法是测定抗体的常用方法。可以用一种酶标抗 抗体检测多种抗体。,C、竞争结合法 可用于测定小分子抗原或半抗原及抗体。以检测抗原为例，待测抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，结合于固相的酶标抗原量与标本中待测抗原含量呈反比。,D、捕获法最常用于检测IgM抗体包被抗人IgM 链+待测标本-IgM类抗体全被固相抗体捕获-洗涤+ 特异性抗原（针对待测IgM的相应抗原）与固相上特异性IgM结合+酶标抗体（针对特异性Ag的）+底物-显色-显色表示有特异性IgM。,E、 BAS-ELISA 生物素（B） -亲

9、和素（A）系统（ biotin avidin system，BAS）是以生物素和亲和素具有的独特结合特性为基础，它们的结合迅速、专一、稳定，并具有多级放大效应。 应用生物素亲和素放大系统的ELISA，使反应信号放大， 检测灵敏度提高。,1个亲和素（链霉亲和素）可结合四个生物素衍化物 1个抗体可结合多个B，与蛋白质-NH2结合形成 肽键，-NH2越多，标记B越多。 E B Ag?EB ABE B Ab B B B E EBABE,BAS-ELISA包括：ABC-ELISA （间接法、双抗体夹心法） BA-ELISA （间接法、双抗体夹心法） BAB-ELISA （间接法、双抗体夹心法）例如：BA

10、B-ELISA（双抗体夹心法）：固相Ab+待检Ag+（Ab-B）+ A + B-E + 底物显色,ABC-ELISA （间接法、双抗体夹心法）,（四）酶免疫组化（EIH） 原理：以酶标记抗体与用于相应抗原反应，通过底物被酶解显色以示踪抗原-抗体结合物存在的部位。 酶免疫组化染色标本可在普通光学显微镜下观察，并能长期保存。 此外，作为辣根过氧化物酶底物的二氨基联苯胺（DAB），其分解产物为不溶性，适于镜下观察。,1、直接法 组织标本待测抗原+ 酶标记抗体DAB显色 2、间接法 组织标本待测抗原 + Ab1 + 酶标-二抗 使用一种酶标抗体可检测多种抗原。敏感性较直 接法高，但低于PAP法。,3、

11、生物素-亲和素法 将亲和素（A）与生物素（B）系统应用于酶免疫组化 包括：ABC法（直接法、间接法） BAB法（直接法、间接法） BA法 （直接法、间接法）,3.,1）ABC法 直接ABC法:玻片Ag + BAb Ag-AbB ABC Ag-AbB-AB*C 特点:将BAB法中的A先与BE结合，制备成复合物ABC 间接ABC法：用生物素化的第二抗体与抗原抗体复合物结合 玻片Ag + Ab1 Ag-Ab1 BAb2 Ag-Ab1-Ab2B ABC Ag-Ab1-Ab2B-AB*C,2）BAB法（桥联亲合素-标记生物素法BRAB） 直接BAB法: 组织切片或细胞涂片Ag + BAb Ag-AbB

12、A Ag-AbB-A BE Ag-AbB-A-BE 特点：以游离A分别连接BAb和BE 间接BAB法：用生物素化的第二抗体与抗原抗体复合物结合 组织切片或细胞涂片Ag + Ab1 Ag-Ab1 BAb2 Ag-Ab1-Ab2B A Ag-Ab1-Ab2B-A BE Ag-Ab1-Ab2B-A-BE,3）BA法（标记亲合素-生物素法LAB法） 直接BA（或LAB）法 玻片Ag + BAb Ag-AbB AE Ag-AbB-AE 特点：以AE/SAE代替BAB法中的A，省却了加BE的步骤 间接BA（或LAB）法：用生物素化的第二抗体与抗原抗体复合物结合 玻片Ag + Ab1 Ag-Ab1 BAb2

13、 Ag-Ab1-Ab2B AE Ag-Ab1-Ab2B-AE,BAS实验方法及反应层次,方 法 反应层次 直接法 BA Ag(Ab-B)A* BAB Ag(Ab-B)AB* ABC Ag(Ab-B)AB*C 间接法 BA AgAb1(Ab2-B)A* BAB AgAb1(Ab2-B)AB* ABC AgAb1(Ab2-B)AB*C Ag 抗原； Ab-B 生物素化抗体； A 亲合素； A* 标记亲合素； B 生物素； B* 标记生物素； Ab1 第一抗体； Ab2 第二抗体; Ab2-B 生物素化第二抗体,4、过氧化物酶-抗过氧化物酶（peroxidase anti-peroxidase co

14、mplex，PAP）法和碱性磷酸酶-抗碱性磷酸酶（alkaline phosphatase-antialkaline phosphatase，APAAP）法 原理：应用抗酶抗体与酶结合，形成可溶性、稳定的酶-抗酶抗体复合物。此法优点是：未经化学交联反应，故避免了抗体和酶活性降低，并省去酶标记抗体需纯化的繁复过程。,二、荧光免疫技术（fluoroimmunoassay） 原理：以荧光素标记的抗体或抗原，用于相应抗原或抗体的分析鉴定。 荧光免疫技术分为： 免疫荧光显微技术（荧光免疫组化）：用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原（或抗体）进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察实验结果，

15、流式细胞术：进行自动分析检测 荧光免疫测定：用于检测体液标本中抗原或抗体。,（一）常用的荧光色素,1、异硫氰酸荧光素（FITC）橙黄色/黄色粉末，发出黄绿色荧光。最大吸收峰490495nm，最大发射峰520530nm，含异硫氰基-N=C=S。应用最多的荧光素。 2、四乙基罗丹明（RB200）橘红色粉末，发出橘红色或橙色荧光。最大吸收峰570nm，最大发射峰595600nm。含磺酸基。与FITC做双标记或对比染色。 3、藻红蛋白（R-RE） 发出橙色荧光，最大吸收峰565nm，最大发射峰575nm，可与FITC共用488nm激发光，可用于流式细胞仪的双标记。,（二）免疫荧光显微技术 1、方法及原

16、理 1）直接法 应用特异性荧光抗体直接检查标本中的相应抗原。 2）间接法 以特异性抗体（或待测抗体）为第一抗体，以荧 光素标记的抗球蛋白抗体（标记的抗抗体）为第 二抗体，用于检测抗原或抗体。,3）补体法 此法是在间接法的第一步抗原-抗体反应加入补体，使之与抗原-抗体复合物结合；再用荧光素标记的抗补体抗体进行示踪。 4）双标记法 此法用异硫氰酸荧光素（FITC）及罗丹明（TRITC）分别标记不同抗体，进行同一标本的荧光染色，若有两种相应抗原存在，可同时见两种（橙红、黄绿）荧光。,2、荧光显微镜检查 1）染色标本尽可能立即观察结果。 2）镜下观察时同一标本区观察时间不易过长。 3）通风较好的暗室中

17、进行。 4）油镜检查时用无荧光镜油，先观察对照，再看待测标本。,（三）流式细胞术（FCM） FCM是将免疫荧光技术应用于流式细胞仪，对单个细胞表面标志（抗原或受体）进行快速、精确分析和自动检测，并可对不同类型细胞进行分选和收集。FCM还可对同一细胞的多种参数（如DNA、RNA、蛋白质和细胞体积等）进行多信息分析，故成为当代生命科学研究领域中被广泛应用的一项新技术。,1、基本概念与原理 FCM是一种分析单个微粒（如细胞、微生物和人工合成微球等）物理和化学特性的技术，其特点是快速、准确、客观，能定量。 FCM的原理：悬浮在液体中的分散细胞单个地依次通过测量区时产生电信号，从而可快速对大量细胞进行多

18、参数检测和分析，并可从整个群体中分选出特定的细胞亚群。,2、流式细胞术在免疫细胞研究中的应用 1）细胞表型分析 表型分析可用于免疫细胞鉴定、计数和功能评价。 2）细胞功能检测 （1）细胞功能状态和活化信号转导： 包括检测胞内钙离子浓度、蛋白磷酸化、蛋白激酶活性状态、信息传递相关蛋白表达及相互作用等。,（2）细胞增殖： 应用活细胞染料5-二醋酸羧基荧光素琥珀酸单胞菌酯（5-carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester，CFSE）作为标记物，建立了检测细胞增殖的新技术。原理：CFSE能自动穿过胞膜，与胞内蛋白赖氨酸不可逆结合，并随细胞分裂而倍减，借助FCM检测荧光强度，可判断细胞的增殖状态。,（3）细胞分化： 借助胞内细胞因子染色