蛋白质化学课件

1、绪 论,生物化学是关于生命的化学，是运用化学的原理和方法来研究生命现象，阐明生命现象变化规律的一门科学。现在也利用物理、生物学的方法。,一、生物化学的概念,章首,器官（肝脏）,消化系统,肝脏 窦状小管,肝细胞,细胞核,分子（DNA）,生物化学涉及的主要问题：,1）生物分子的化学和三维结构是什么？ 2）生物分子如何进行相互反应？ 3）细胞如何合成和降解生物分子？ 4）能量如何守恒并被细胞利用？ 5）组装生物分子并协调它们的活性的机制是什么？ 6）遗传信息是如何存储、传递和表达的？,分子生物学概念及研究内容,广义: 研究蛋白质及核酸等生物大分子结构和功能，也就是从分子水平阐明生命现象和生物学规律。

2、 狭义: 偏重于核酸(或基因)的分子生物学，主要研究基因或DNA的复制、转录、表达和调节控制等过程，也涉及这些过程中有关的蛋白质和酶的结构与功能的研究。,生物化学的发展,1 静态生物化学时期（二十世纪二十年代以前） 2 动态生物化学时期（二十世纪前半叶） 3 机能生物化学及分子生物学时期（二十世纪五十年代以后）,静态生物化学的发展,静态生物化学发展描述的是有机生物化学发展时期（17701903）。这个时期的生物化学更多地依附于有机化学，大量工作是围绕着生命的存在方式“蛋白质”进行的。 1903年，有人首先使用“biochemistry”这个单词,它反映了作为独立学科的生物化学的诞生。,章首,节

3、首,动态生物化学的发展,动态生物化学是生理生物化学的发展时期（19031950）。19世纪中叶，生物学积累了若干有关血液循环和消化、吸收的知识，巴甫洛夫消化生理学比较完整地建立起来了。开始探索生理功能的化学过程，从而派生出了生理生物化学。,章首,节首,功能生物化学的发展,1950年以后,由于各种现代化技术和设备的发明和发展，生物化学进入了分子的或综合生物化学发展时期。这期间，生物化学的进展，更集中、更突出地反映在蛋白质、酶和核酸等生物大分子研究上，使生命起源研究进入了新的发展时期。同时，开始应用生物化学方法改变遗传特性，创立了遗传工程学。,章首,节首,四、生物化学的成就,1953年，DNA双螺

4、旋结构模式 1958年，分子遗传的中心法则 1970年，基因工程方法的建立 1981年，发现有催化功能的RNA（Ribozyme） 1985年，人类基因组作图和测序计划 1993年，P53被“Science”评为年度分子明星 1997年，第一只克隆羊诞生 1999年，干细胞的研究位列当年科技重大突破首位 2000年，人类基因组作图计划即将完成 2002年，RNAi荣登重大科技突破榜首 2005年，观察进化发生位列科技突破首位,章首,DNA双螺旋结构模式,DNA分子结构是由美国生物学家沃森（James Dewey Watson,1926）和英国生物物理学家克里克（Francis Harry Co

5、mpton Crick,1916）所确定的。克里克于1949年入剑桥大学卡文迪什实验室医学研究组。1951年沃森来到该研究所，克里克接受了他的观点：了解DNA三维结构即可明了它在遗传中所起的作用。1953年，他们建立了DNA双螺旋结构模式,并跟已知的物理化学性质相符合。这一发现成为分子生物学的里程碑。后来他们分享了62年的诺贝尔生理医学奖。,章首,节首,分子遗传的中心法则,中心法则(central dogma)是指遗传信息的流向所遵循的法则。Crick提出，在DNA分子可以自我复制（replication）传给子代的基础上，遗传信息可以从DNA传递给RNA（称为转录transcription）

6、再从RNA传递给蛋白质（称为翻译translation），这是遗产信息流所遵循的中心法则。 Temin又证实RNA也可以是遗传信息的携带者，即DNA以RNA为模板反向转录合成，再推动RNA的合成及蛋白质的合成。,章首,节首,图片,分子遗传的中心法则,章首,节首,基因工程方法的建立,1970年，Temin和Baltimore从鸡肉瘤病毒中发现反转录酶。 Smith和Wilcox在E.coli中发现限制性内切酶,由此为基因工程方法的建立打下了基础。,章首,节首,Ribozyme,章首,节首,1978年，Altman在提纯RNAaseP时发现，此酶由蛋白质和一个RNA片段组成，单独的RNA能完成对前

7、体tRNA的剪切，而单独的蛋白质却无此能力。1981年，Cech在研究四膜虫前体rRNA的加工过程中发现，在没有蛋白质存在的情况下，一段RNA序列（IVS）能进行自动剪切，生成L-19IVS。后者在离体条件下能催化五聚胞嘧啶核苷酸的合成。由此提出了具有催化功能的核酸（Ribozyme）的概念。 Ribozyme的提出为解决人类的起源问题提供了一种新的假说，为此，Cech与Altman共同获得了1989年化学诺贝尔奖。,“人类基因组作图和测序”计划,1985年，美国科学家率先提出“人类基因组测序和作图”计划（简称HGP）。国际合作始于1990年 该计划的核心就是测定人类基因组的全部DNA序列，从

8、整体上破译人类遗传信息，以使人类能在分子水平上全面地认识自我。 HGP的精神是：全球共有，国际合作。即时公布，免费共享。,章首,节首,P53被“Science”评为年度分子明星,p53基因是一种肿瘤抑制基因，定位于人类17号染色体短臂，其编码的p53磷蛋白具有调控细胞增殖功能。大量实验表明，人体内约50%的肿瘤发生与p53的缺失，突变有关，也与p53蛋白与病毒蛋白的结合，导致p53蛋白失活有关。 03年10月央视国际报道了我国用于恶性肿瘤治疗的基因药物诞生并批准上市。这种由深圳赛百诺基因技术有限公司研制的基因药物名为重组腺病毒P53抗癌注射液，主要用于治疗头颈部鳞癌和其他恶性肿瘤。,章首,节首

9、,老化：抑制癌症的代价？ 在细胞水平，p53可以使细胞停止分裂最终导致细胞死亡。在器官水平，p53的过量会导致衰老 p53蛋白：长寿的敌人？ 当降低果蝇神经细胞中p53蛋白活性，果蝇寿命明显延长,p53与细胞凋亡,克隆羊诞生,章首,节首,1997年2月23日，英国罗斯林研究所宣布，他们成功创造了世界上第一个克隆羊 多莉。它的意义在于，人类已能用高度分化的乳腺细胞作为核供体，通过无性繁殖方法，复制出与核供体完全一致的新个体。,1999年干细胞的研究工作位列年度科学技术重大突破首位,干细胞（stem cell）是一类既有自我更新能力，又有多分化潜能的细胞。干细胞的研究一方面可以揭示许多有关细胞生长

10、和发育的基础理论难题；另一方面可望将其用于创伤修复，神经再生和抗衰老等临床医学研究。,章首,节首,上一页,人类基因组计划即将完成,2000年6月26日，参与人类基因组计划的各国科学家，同时向全世界宣布人类基因组“工作框架图”绘制完成。 2004年10月21日出版的自然杂志公布了人类基因组最精确的序列（包含有28.5亿个碱基对），同时澄清人类基因组只有2到2.5万个基因（而不是原来的10万个基因） 这篇文章标志着人类基因组计划又迈出了里程碑意义的一步。,章首,节首,上一页,下一页,人类基因组计划的应用前景,将揭示生命世界的一些重大奥秘，如生命起源，生物进化等。 将应用于疾病的诊断和治疗，将改变2

11、1世纪的医学。 将有利于人类培育优良的动植物品种。 将大大促进生命科学工业的发展，特别是基因制药工业的发展。,章首,节首,上一页,精神病基因的发现,研究人员确认了增加患上由家族遗传的精神分裂、抑郁症和其他精神疾病的基因。发现了一组增加患上抑郁症机会的基因，但患者在受到严重压力下才会触发基因活动。 这一成果位列2003年重大科技突破第二位,垃圾DNA,人体内非编码虽然占人体基因组的，但它却不像编码基因那样控制产生特定的蛋白质，所以曾经被称为“垃圾”。英国科学家最近研究发现，这些貌似无用的对某些疾病的严重程度却有着很大影响。 这些DNA对于基因在正确的位置和正确的时间“开启”起到关键的帮助 这一成

12、果位列04年重大科技突破第五位,返回,2002年 RNAi荣登重大科技突破榜首,RNA曾被认为是一种缺乏活力的生物分子，但最近一系列发现表明，一些小分子RNA参与着多项细胞控制工作，能够关闭基因或改变它们的表达水平。这一现象称为核糖核酸干扰（RNAi），它是体内抵御外在感染的一种重要保护机制。小RNA的这种功能有可能使21世纪的医药研究产生革命性的变化。,章首,节首,世界首次RNAi临床试验初获成功,2006年6月，美国一项研究显示，导致老年人失明的最常见病因老年性黄斑变性（AMD），能够通过siRNA分子来对付。这些结果是由评估RNAi(RNA干扰)疗法对人类患者效果的首次临床试验获得。,2

13、005年 观察进化发生位列科技突破首位,自从达尔文1859年把进化理论首次引入科学界以来，该理论一直是生物学的基础，但也受到其它理论的挑战。2005年研究人员在对1918年大流行的流感病毒基因、黑猩猩基因以及其它物种的基因进化研究中发现，达尔文的进化理论仍然对当代生物学具有指导意义。并且这些研究成果对现实生活具有重要影响。,五、生物化学与现代工业,生物化学对现代化工、轻工、食品、医药工业的渗透 1、在传统食品工业中的应用 工业用酶在食品工业中的大量应用； 2、在发酵工业中的应用 各种有机酸等化工产品的生产；各类抗生素的生产 3、在现代医药行业中的应用 用基因工程手段生产人胰岛素、干扰素等重要药

14、物,生物化学与医药学,生物化学的理论与技术已渗透到医学科学的各个领域 生物化学与分子生物学在生命科学中占有重要的地位 生物化学的发展促进了疾病病因、诊断和治疗的研究,六、如何学好生物化学？,掌握生物化学的整体框架 经常关注生命科学的前沿进展 1、Nature、Science、Cell等国外期刊 2、生命的化学、生物化学与生物物理进展、生物工程进展等国内期刊 生物化学是实践性很强的学科,第一章 蛋白质化学,授课教师：陈希宏,蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。,第一章 蛋白质(Protein),第一节

15、 概 述,一、蛋白质的定义 蛋白质：是一切生物体中普遍存在的，由天然氨基酸通过肽键连接而成的生物大分子；其种类繁多，各具有一定的相对分子质量，复杂的分子结构和特定的生物功能；是表达生物遗传性状的一类主要物质。 二、蛋白质在生命中的重要性 早在1878年，思格斯就在反杜林论中指出：“生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。” 可以看出，第一，蛋白体是生命的物质基础；第二，生命是物质运动的特殊形式，是蛋白体的存在方式；第三，这种存在方式的本质就是蛋白体与其外部自然界不断的新陈代谢。现代生物化学的实践完全证实并发展了恩格斯的论断,1.蛋白质是生物体内

16、必不可少的重要成分,蛋白质占干重 人体中 人体 45% 水55% 细菌 50%80% 蛋白质19% 真菌 14%52% 脂肪19% 酵母菌 14%50% 糖类1% 白地菌50% 无机盐7%,2.蛋白质是一种生物功能的主要体现者,（1）酶的催化作用 （2）调节作用(多肽类激素) （3）运输功能 （4）运动功能 （5）免疫保护作用(干扰素) （6）接受、传递信息的受体 （7）毒蛋白,3.外源蛋白质有营养功能，可作为生产加工的对象.,三、蛋白质的组成,元素组成 蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质

17、中的组成百分比约为： 碳 50 氢 7 氧 23 氮 16% 硫 03 其他 微 量,氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分。因此，可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。由于大多数蛋白质的含氮量接近于16%，所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量,蛋白质含量的测定： 凯氏定氮法 (测定氮的经典方法) 优点：对原料无选择性，仪器简单， 方法也简单； 缺点：易将无机氮都归入蛋白质中。 一般，样品含氮量平均在16%，取其倒数100/16=6.25，即为蛋白质换算系数，其含义是样品中每存在1g元素氮，就说明含有6.25g 蛋白质）；故： 蛋白质含量=氮的量6.25,蛋白质含量测

18、定除了上法外，还有 紫外比色法 双缩脲法 Folin酚 考马斯亮兰G250比色法 （条件：蛋白质必须是可溶的）,蛋白质的分类,（一）按分子形状分类 1球状蛋白质：形状类似球形或椭球形，多溶于水，细胞中的大多数都属于球状蛋白质，如血红蛋白、肌红蛋白、酶、抗体等。 2纤维状蛋白质：形状呈细棒或纤维状，大都是结构蛋白，如胶原蛋白、弹性蛋白、角蛋白质。这些起结构作用的纤维状蛋白是不溶于水的。但有些纤维状蛋白质，如血液中的纤维蛋白原、肌肉中的肌球蛋白等是可溶的。,3膜蛋白：与生物膜结合的蛋白质在形状上不同于上述两类，与膜结合部分主要是平行排列的-螺旋，是水不溶性的。 （二）按化学组成分类 1简单蛋白质：

19、完全由氨基酸组成，不含其他化学成分。如核糖核酸酶、胰岛素等。溶解度不同的简单蛋白质有清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶谷蛋白、组蛋白、鱼精蛋白、硬蛋白。 2、结合蛋白质：除了蛋白质部分外，还含有非蛋白质成分，其中非蛋白质成分称为辅因子或配基。根据配基又分为糖蛋白、脂蛋白、核蛋白、磷蛋白、色蛋白、金属蛋白、黄素蛋白。,蛋白质的生物功能,（一）催化功能 生物体内的各种化学反应几乎都是在相应生物催化剂酶的作用下进行的。已鉴定出的酶几乎都是蛋白质。所以作为有机体新陈代谢的催化剂，酶是蛋白质最重要的生物学功能之一。,（二）结构成分 有些蛋白质可以作为生物体的结构成分，这些蛋白称为结构蛋白。如高等动物的胶原蛋白

20、参与结缔组织和骨骼的形成，作为身体的支架；头发、指甲和皮肤中的不溶性角蛋白，形成体表的保护层；弹性蛋白参与血管壁和韧带的构造，起支持和润滑作用。结构蛋白一般是不溶性纤维状蛋白质。,（三）转运蛋白 这类蛋白质具有转运功能，能携带各种物质从一处到另一处。如血液中的血红蛋白，将氧气从肺运输到其他组织，供生物氧化之用，同时，将二氧化碳从其他组织运输到肺，以便排除体外。另外一些转运蛋白还能将代谢物转运而进出细胞。,（四）贮存功能 有些蛋白质有贮藏氨基酸的功能，用作有机体及其胚胎生长发育的原料，这类蛋白质有蛋类中的卵清蛋白、乳中的酪蛋白、小麦种子中的麦醇溶蛋白。,（五）运动功能 人和动物的运动靠肌肉的收缩

21、来实现，肌肉收缩实际上是肌球蛋白和肌动蛋白丝状体的滑动运动。另外，细菌的鞭毛和纤毛是由许多微管蛋白组装起来的，也能产生类似的运动。非肌肉的运动系统中普遍存在着一类运动蛋白马达蛋白（motor protrin），可驱使小泡、颗粒和细胞器沿微管轨道运动。,（六）调节蛋白 许多蛋白质有调节其他蛋白质执行其生理功能的能力，这些蛋白称为调节蛋白。如胰岛素（insulin），胰岛素是动物胰脏 细胞分泌的一种激素蛋白，参与血糖的代谢调节，能降低血液中的葡萄糖的含量。还有一些调节蛋白参与基因表达调控，它们激活或抑制遗传信息转录为mRNA。如大肠杆菌的CAP和阻遏蛋白。,（七）防御功能 有些蛋白质具有主动的防御

22、功能，以抵抗外界不利因素对生物体的干扰。如脊椎动物体内的免疫球蛋白（immunoglobulin）（或称为抗体），能够识别特异的抗原（如病毒、细菌和其他生物体的细胞）并与之结合以清除抗原，因此它具有防御疾病和抵抗外界病原侵袭的免疫能力。南极水域某些鱼类血液中含有抗冻蛋白，保护血液不被冻凝。蛇毒和蜂毒的溶血蛋白和神经毒蛋白以及一些植物毒蛋白（蓖麻蛋白）等，少量即可引起高等动物产生强烈毒性发言。,（八）信息传递功能 在生物体内有一类蛋白质起接受和传递信息的作用，即受体蛋白，如接受各种激素的受体蛋白等。,第二节 氨基酸化学,一、氨基酸的结构与分类,(2). 除甘氨酸外,其它所有氨基酸分子中的-碳原子

23、都为不对称碳原子,所以：A.氨基酸都具有旋光性。B.每一种氨基酸都具有D-型和L-型两种立体异构体。目前已知的天然蛋白质中氨基酸都为L-型。,1.氨基酸的结构 氨基酸是蛋白质水解的最终产物，是组成蛋白质的基本单位。从蛋白质水解物中分离出来的氨基酸有二十种，除脯氨酸和羟脯氨酸外，这些天然氨基酸在结构上的共同特点为：,(1). 与羧基相邻的-碳原子上都有一个氨基，因而称为-氨基酸,COOH H2N CH -碳原子基团 R R基团,-氨基酸基本结构通式,L-氨基酸的结构通式,-氨基酸的立体异构体（一）,-氨基酸的立体异构体（二）,（一）氨基酸的分类：,根据R侧链基团解离性质的不同，可将氨基酸分为三大

24、类： 1. 酸性氨基酸Glu，Asp；侧链基团在中性溶液中解离后带负电荷的氨基酸。 2. 碱性氨基酸His，Arg，Lys；侧链基团在中性溶液中解离后带正电荷的氨基酸。,3. 中性氨基酸 侧链基团在中性溶液中不发生解离，因而不带电荷的氨基酸。可分为： a) 极性氨基酸：Tyr，Cys，Ser，Thr，Asn，Gln，Met，Trp； b) 非极性氨基酸：Gly，Ala，Val，Leu，Ile，Pro，Phe。,3.构成蛋白质的20种氨基酸,二.氨基酸的重要理化性质 1.一般物理性质 常见氨基酸均为无色结晶,其形状因构型而异,溶解性：各种氨基酸在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不

25、能溶解于有机溶剂。通常酒精能把氨基酸从其溶液中沉淀析出。 (2) 熔点：氨基酸的熔点极高，一般在200以上。 (3) 味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的为甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。 旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用（-）表示，右旋者用（+）表示。 (5)光吸收：构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(220nm)均有光吸收。在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。,酪氨酸的max275nm，275=1.4x103; 苯丙氨酸的max257nm，25

26、7=2.0 x102; 色氨酸的max280nm，280=5.6x103;,3.氨基酸的等电点,当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。 侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK1和pK2的算术平均值：pI = (pK1 + pK2 )/2 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK值的算术平均值。 酸性氨基酸：pI = (pK1 + pKR-COO- )/2 硷性氨基酸：pI = (pK2 +

27、pKR-NH2 )/2,4.氨基酸的化学性质,(1)与茚三酮的反应（颜色反应）,溶液pH值与氨基酸等电点的关系,氨基酸与水合茚三酮共热，发生氧化脱氨反应，生成NH3与酮酸。水合茚三酮变为还原型茚三酮。 加热过程中酮酸裂解，放出CO2，自身变为少一个碳的醛。水合茚三酮变为还原型茚三酮。 NH3与水合茚三酮及还原型茚三酮脱水缩合，生成蓝紫色化合物。,反应要点 A.该反应由NH2与COOH共同参与 B.茚三酮是强氧化剂 C.该反应非常灵敏，可在570nm测定吸光值 D. 测定范围：0.550g/ml E.脯氨酸与茚三酮直接生成黄色物质（不释放NH3） 应用： A.氨基酸定量分析（先用层析法分离） B

28、.氨基酸自动分析仪： 用阳离子交换树脂，将样品中的氨基酸分离，自动定性定量，记录结果。,(2)与甲醛反应 A.为- NH2的反应 B.在常温，中性条件，甲醛与- NH2很快反应，生成羟甲基衍生物，释放氢离子。 应用：氨基酸定量分析甲醛滴定法（间接滴定） A.直接滴定，终点pH过高（12），没有适当指示剂。 B.与甲醛反应，滴定终点在9左右，可用酚酞作指示剂。 C.释放一个氢离子，相当于一个氨基（摩尔比1：1） D.简单快速，一般用于测定蛋白质的水解速度。,(3) 与2,4-二硝基氟苯（DNFB）反应 A.为- NH2的反应 B.氨基酸- NH2的一个H原子可被烃基取代(卤代烃) C.在弱碱性条

29、件下，与DNFB发生芳环取代，生成二硝基苯氨基酸 应用：鉴定多肽或蛋白质的N-末端氨基酸 A.虽然多肽侧链上的- NH2、酚羟基也能与DNFB反应，但其生成物，容易与- DNP氨基酸区分和分离,首先由Sanger应用，确定了胰岛素的一级结构 A. B.水解DNP-肽，得DNP-N端氨基酸及其他游离氨基酸 C.分离DNP-氨基酸 D. 由Edman于1950年首先提出 为- NH2的反应 用于N末端分析，又称Edman降解法,肽分子与DNFB反应，得DNP-肽,层析法定性DNP-氨基酸，得出N端氨基酸的种类、数目,(4)与异硫氰酸苯酯（PITC）的反应,第三节 蛋白质的分子结构,蛋白质是由一条或

30、多条多肽(polypeptide)链以特殊方式结合而成的生物大分子。 蛋白质与多肽并无严格的界线，通常是将分子量在6000道尔顿以上的多肽称为蛋白质。 蛋白质分子量变化范围很大, 从大约6000到1000000道尔顿甚至更大,一.基本问题-肽 一个氨基酸的氨基与另一个氨基酸的羧基之间失水形成的酰胺键称为肽键，所形成的化合物称为肽。 由两个氨基酸组成的肽称为二肽，由多个氨基酸组成的肽则称为多肽。组成多肽的氨基酸单元称为氨基酸残基。 1.多肽,在多肽链中，氨基酸残基按一定的顺序排列，这种排列顺序称为氨基酸顺序 通常在多肽链的一端含有一个游离的-氨基，称为氨基端或N-端；在另一端含有一个游离的-羧基

31、，称为羧基端或C-端。 氨基酸的顺序是从N-端的氨基酸残基开始，以C-端氨基酸残基为终点的排列顺序。如上述五肽可表示为： Ser-Val-Tyr-Asp-Gln,2.肽键,肽键的特点是氮原子上的孤对电子与羰基具有明显的共轭作用。 组成肽键的原子处于同一平面。 肽键中的C-N键具有部分双键性质，不能自由旋转。 在大多数情况下，以反式结构存在。,3.天然存在的重要多肽,在生物体中，多肽最重要的存在形式是作为蛋白质的亚单位。 但是，也有许多分子量比较小的多肽以游离状态存在。这类多肽通常都具有特殊的生理功能，常称为活性肽。 如：脑啡肽；激素类多肽；抗生素类多肽；谷胱甘肽；蛇毒多肽等。,+H3N-Tyr

32、-Gly-Gly-Phe-Met-COO- +H3N-Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-COO- Met-脑啡肽 Leu-脑啡肽,二.蛋白质的一级结构,1. 蛋白质的一级结构(Primary structure)包括： (1)组成蛋白质的多肽链数目. (2)多肽链的氨基酸顺序， (3)多肽链内或链间二硫键的数目和位置。 其中最重要的是多肽链的氨基酸顺序，它是蛋白质生物功能的基础。,2.蛋白质的一级结构的测定,蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。 (1) 测定蛋白质的一级结构的要

33、求,A.样品必需纯（97%以上）； B.知道蛋白质的分子量； C.知道蛋白质由几个亚基组成； D.测定蛋白质的氨基酸组成；并根据分子量计算每种氨基酸的个数。 E.测定水解液中的氨量，计算酰胺的含量。,(2)测定步骤 多肽链的拆分：由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基).,测定蛋白质分子中多肽链的数目：通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。 二硫键的断裂：几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在可

34、用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的-巯基乙醇处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。可以通过加入盐酸胍方法解离多肽链之间的非共价力；应用过甲酸氧化法或巯基还原法拆分多肽链间的二硫键。,巯基的保护,测定每条多肽链的氨基酸组成，并计算出氨基酸成分的分子比； 分析多肽链的N-末端和C-末端 末端氨基酸的测定：多肽链端基氨基酸分为两类，N-端氨基酸和C-端氨基酸。在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。末端氨基酸测定的主要方法有：,Edman （苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循

35、环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。,肽链（N端氨基酸）与PITC偶联，生成PTC-肽 环化断裂：最靠近PTC基的肽键断裂，生成PTC-氨基酸和少 一残基的肽链，同时PTC-氨基酸环化生成PTH-氨基酸 分离PTH-氨基酸 层析法鉴定 用DNS(二甲基萘磺酰氯)测定N端氨基酸 原理DNFB法相同 但水解后的DNS-氨基酸不需分离，可直接用电泳或层析法鉴定 由于DNS有强烈荧光，灵敏度比DNFB法高100倍，比Edman法高几到十几倍 可用于微量氨基酸的定量,丹磺酰氯法:在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。此法的优点是丹磺酰-

36、氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到110-9mol。,肼解法：此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。,氨肽酶法：氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。 羧肽酶法：羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解。根基不同的

37、反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。,多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。多肽的选择性降解的方法有：,酶解法:胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶 化学法：溴化氰水解法，它能选择性地切割由甲硫氨酸的羧基所形成的肽键。,测定每个肽段的氨基酸顺序。 确定肽段在多肽链

38、中的次序：利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序。 确定原多肽链重二硫键的位置：一般采用胃蛋白酶处理没有断开二硫键的多肽链，再利用双向电泳技术分离出各个肽段，用过甲酸处理后，将每个肽段进行组成及顺序分析，然后同其它方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。,三.蛋白质的空间结构 1.蛋白质的二级结构 蛋白质的二级(Secondary)结构是指肽链的主链在空间的排列,或规则的几何走向、旋转及折叠。它只涉及肽链主链的构象及链内或链间形成的氢键。主要有-螺旋、-折叠、-转角。 (1). -螺旋,相邻的肽平面构成两面角取几乎相同数值 多肽链中的各个肽平面围绕同一轴

39、旋转，形成螺旋结构，螺旋一周，沿轴上升的距离即螺距为0.54nm,含3.6个氨基酸残基；两个氨基酸之间的距离0.15nm. 肽链内形成氢键，氢键的取向几乎与轴平行，第一个氨基酸残基的酰胺基团的-CO基与第四个氨基酸残基酰胺基团的-NH基形成氢键。 蛋白质分子为右手-螺旋。,左手和右手螺旋,（2） -折叠 -折叠是由两条或多条几乎完全伸展的肽链平行排列，通过链间的氢键交联而形成的。肽链的主链呈锯齿桩折叠构象。 在-折叠中，-碳原子总是处于折叠的角上，氨基酸的R基团处于折叠的棱角上并与棱角垂直，两个氨基酸之间的轴心距为0.35nm. -折叠结构的氢键由两条肽链之间形成的；也可以在同一肽链的不同部分

40、之间形成。几乎所有肽键都参与链内氢键的交联，氢键与链的长轴接近垂直。 -折叠有两种类型。一种为平行式，即所有肽链的N-端都在同一边。另一种为反平行式，即相邻两条肽链的方向相反。,（3） -转角 在-转角部分，由四个氨基酸残基组成.四个形成转角的残基中，第三个一般均为甘氨酸残基弯曲处的第一个氨基酸残基的 -C=O 和第四个残基的 N-H 之间形成氢键，形成一个不很稳定的环状结构。这类结构主要存在于球状蛋白分子中。,（）自由回转 没有一定规律的松散肽链结构，但仍是紧密有序的稳定结构，通过主链间及主链与侧链间氢键维持其构象不同的蛋白质，自由回转的数量和形式各不相同分两类： 紧密环 连接条带,超二级结

41、构和结构域 （）超二级结构 在蛋白质分子中，由若干相邻的二级结构单元组合在一起，彼此相互作用，形成有规则的、在空间上能辨认的二级结构组合体。几种类型的超二级结构： ； 超二级结构在结构层次上高于二级结构，但没有聚集成具有功能的结构域, ,（）结构域（Domain) 对于较大的蛋白质分子或亚基，多肽链往往由两个或两个以上相对独立的三维实体缔合而成三级结构。这种相对独立的三维实体就称结构域。 结构域通常是几个超二级结构的组合，对于较小的蛋白质分子，结构域与三级结构等同，即这些蛋白为单结构域。 结构域一般由100200 个氨基酸残基组成，但大小范围可达 40400 个残基。氨基酸可以是连续的，也可以

42、是不连续的 结构域之间常形成裂隙，比较松散，往往是蛋白质优先被水解的部位。酶的活性中心往往位于两个结构域的界面上 结构域之间由“铰链区”相连，使分子构象有一定的柔性，通过结构域之间的相对运动，使蛋白质分子实现一定的生物功能。 在蛋白质分子内，结构域可作为结构单位进行相对独立的运动，水解出来后仍能维持稳定的结构，甚至保留某些生物活性,结构域与功能域的关系： 有时一个结构域就是蛋白质的功能域，但不总是 包含一个但通常是多个结构域 蛋白质的三级结构 蛋白质的三级结构是指多肽链在二级结构的基础上进一步盘旋、折叠，从而生成特定的空间结构。包括主链和侧链的所有原子的空间排布一般非极性侧链埋在分子内部，形成

43、疏水核，极性侧链在分子表面,蛋白质的四级结构 许多蛋白质是由两个或两个以上独立的三级结构通过非共价键结合成的多聚体，称为寡聚蛋白。寡聚蛋白中的每个独立三级结构单元称为亚基。蛋白质的四级结构是指亚基的种类、数量以及各个亚基在寡聚蛋白质中的空间排布和亚基间的相互作用。如，血红蛋白的四级结构得测定由佩鲁茨1958年完成，其结构要点为： 球状蛋白，寡聚蛋白，含四个亚基 两条链，两条链，22 链：141个残基； 链：146个残基 分子量65 000 含四个血红素辅基 亲水性侧链基团在分子表面，疏水性基团在分子内部,三蛋白质分子中的共价键与次级键 一级结构二级结构超二级结构结构域三级结构亚基四级结构,维系

44、蛋白质分子的一级结构：肽键、二硫键 维系蛋白质分子的二级结构：氢键 维系蛋白质分子的三级结构：疏水相互作用力、氢键、范德华力、盐键 维系蛋白质分子的四级结构：范德华力、盐键,a盐键（离子键 ） b氢键 c疏水相互作用力 d 范德华力 e二硫键 f 酯键,氢键、范德华力、疏水相互作用力、盐键，均为次级键 氢键、范德华力虽然键能小，但数量大 疏水相互作用力对维持三级结构特别重要 盐键数量小 二硫键对稳定蛋白质构象很重要，二硫键越多，蛋白质分子构象越稳定,离子键,氢键,范德华力,疏水相互作用力,第四节 蛋白质分子结构与功能的关系,一.蛋白质一级结构与功能的关系 研究蛋白质一级结构与功能的关系主要是：

45、研究多肽链中不同部位的残基与生物功能的关系。 进行这方面的研究常用的方法有：同源蛋白质氨基酸顺序相似性分析、氨基酸残基的化学修饰及切割实验等。 例1 镰刀形贫血病 患者血红细胞合成了一种不正常的血红蛋白（Hb-S） 它与正常的血红蛋白（Hb-A）的差别：仅仅在于链的N-末端第6位残基发生了变化 （Hb-A）第6位残基是极性谷氨酸残基，（Hb-S）中换成了非极性的缬氨酸残基 使血红蛋白细胞收缩成镰刀形，输氧能力下降，易发生溶血 这说明了蛋白质分子结构与功能关系的高度统一性,例2 一级结构的局部断裂与蛋白质的激活 体内的某些蛋白质分子初合成时，常带有抑制肽，呈无活性状态，称为蛋白质原.蛋白质原的部

46、分肽链以特定的方式断裂后，才变为活性分子. 例：胰岛素，在刚合成时，是一个比成熟的胰岛素分子大一倍多的单链多肽，称为前胰岛素原 前胰岛素原的N-末端有一段肽链，称为信号肽. 信号肽被切去，剩下的是胰岛素原。 胰岛素原比胰岛素分子多一段C肽，只有当C肽被切除后才成为有51个残基，分A、B两条链的胰岛素分子单体.,例3 同源蛋白 同源蛋白：是指在不同有机体中实现同一功能的蛋白质.同源蛋白中的一级结构中有许多位置的氨基酸对所有种属来说都是相同的，称为不变残基；其他位置的氨基酸称可变残基.不同种属的可变残基有很大变化.可用于判断生物体间亲缘关系的远近. 例：细胞色素C 60 个物种中，有 27 个位置

47、上的氨基酸残基完全不变，是维持其构象中发挥特有功能所必要的部位，属于不变残基. 可变残基可能随着进化而变异，而且不同种属的细胞色素 C氨基酸差异数与种属之间的亲缘关系相关。亲缘关系相近者，氨基酸差异少，反之则多（进化树）.,黄色： 不变残基（invariable residues） 蓝色 ： 保守氨基酸（conservative residues） 未标记：可变残基（variable residues）,二.蛋白质的构象与功能的关系 别构效应：又称变构效应，是指寡聚蛋白与配基结合，改变蛋白质构象，导致蛋白质生物活性改变的现象.它是细胞内最简单的调节方式. 例：血红蛋白的别构效应 一个亚基与氧结

48、合后，引起该亚基构象改变 进而引起另三个亚基的构象改变 整个分子构象改变 与氧的结合能力增加,第五节 蛋白质的性质,一.蛋白质的分子大小 蛋白质是分子量很大的生物分子，相对分子质量大于10 000.最高可达40 000 000（烟草花叶病毒） 蛋白质相对分子质量的测定方法 1.根据化学成分测定最小相对分子质量 此法首先利用化学分析方法测定蛋白质分子中某一特殊成分的百分含量 然后，假定蛋白质分子中该成分只有一个，据其百分含量可计算出最低相对分子质量： 最小相对分子质量（已知成分的相对分子、原子质量）/已知成分的百分含量 如果蛋白质分子中所含已知成分不是一个单位，则真实相对分子质量等于最小相对分子

49、质量的倍数。 2. 超离心法 在60 00080 000r/min的高速离心力作用下，蛋白质分子会沿旋转中心向外周方向移动 用光学方法测定界面移动的速度即为蛋白质的离心沉降速度 蛋白质的沉降速度与分子大小和形状有关,沉降系数是溶质颗粒在单位离心场中的沉降速度，用S表示。 一个S单位，为110-13秒 相对分子质量越大，S值越大 蛋白质的沉降系数：1200S 由沉降系数S可根据斯维得贝格Svedberg方程计算蛋白质分子的相对分子质量： M=RST/D1i R：气体常数 T：绝对温度 D：扩散系数 ：溶剂的密度 3.凝胶过滤法 凝胶过滤所用介质为凝胶珠，其内部为多孔网状结构 一定型号的凝胶网孔大

50、小一定，只允许相应大小的分子进入凝胶颗粒内部，大分子则被排阻在外 洗脱时大分子随洗脱液从颗粒间隙流下来，洗脱液体积小；小分子在颗粒网状结构中穿来穿去，历程长，后洗脱下来，洗脱体积大 测定蛋白质分子量一般用葡聚糖，商品名：Sephadex,测得几种标准蛋白质的洗脱体积Ve 以相对分子质量对数（logM）对Ve作图，得标准曲线 再测出未知样品洗脱体积Ve 从标准曲线上可查出样品蛋白质的相对分子质量 4.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法 SDS:十二烷基硫酸钠，变性剂 普通蛋白质电泳的泳动速率取决于荷质比（净电荷、大小、形状） 用SDS和巯基乙醇（打开二硫键）处理 蛋白质变性（肽链伸展）并与SDS结合，

51、形成SDS-蛋白质复合物 不同蛋白质分子的均带负电（SDS带负电）；且荷质比相同（蛋白质分子大，结合SDS多；分子小，结合SDS少） 不同蛋白质分子具有相似的构象 用几种标准蛋白质相对分子质量的对数值对它们的迁移率作图 测出待测样品的迁移率 从标准曲线上查出样品的相对分子质量,影响迁移率的主要因素 凝胶的分子筛效应对长短不同的棒形分子会 产 生不同的阻力主要因素 凝胶的浓度和交联度 同一电泳条件下，分子小，受阻小，游动快，迁移率大。相对分子质量大者，迁移率小 优点：快速，样品用量少，可同时测几个样品 缺点：误差大，约为10（误差主要来源于迁移距离的测量误差） 此方法只能测得 亚基肽链的相对分子

52、质量 二. 蛋白质的两性离解和电泳现象 蛋白质与多肽一样，能够发生两性离解，也有等电点。在等电点时(Isoelectric point pI)，蛋白质的溶解度最小，在电场中不移动。 在不同的pH环境下，蛋白质的电学性质不同。在等电点偏酸性溶液中，蛋白质粒子带负电荷，在电场中向正极移动；在等电点偏碱性溶液中，蛋白质粒子带正电荷，在电场中向负极移动。这种现象称为蛋白质电泳(Electrophoresis)。,蛋白质在等电点pH条件下，不发生电泳现象。利用蛋白质的电泳现象，可以将蛋白质进行分离纯化。,三.蛋白质的胶体性质 由于蛋白质的分子量很大，它在水中能够形成胶体溶液。蛋白质溶液具有胶体溶液的典型

53、性质，如丁达尔现象、布郎运动等。 由于胶体溶液中的蛋白质不能通过半透膜，因此可以应用透析法将非蛋白的小分子杂质除去。 四.蛋白质的沉淀作用 蛋白质胶体溶液的稳定性与它的分子量大小、所带的电荷和水化作用有关。 改变溶液的条件，将影响蛋白质的溶解性质 在适当的条件下，蛋白质能够从溶液中沉淀出来。,1.可逆沉淀 (1)在温和条件下，通过改变溶液的pH或电荷状况，使蛋白质从胶体溶液中沉淀分离。 (2) 在沉淀过程中，结构和性质都没有发生变化，在适当的条件下，可以重新溶解形成溶液，所以这种沉淀又称为非变性沉淀。 (3)可逆沉淀是分离和纯化蛋白质的基本方法，如等电点沉淀法、盐析法和有机溶剂沉淀法等。 2.不可逆沉淀 (1)在强烈沉淀条件下，不仅破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，而且也破坏了蛋白质的结构和性质，产生的蛋白质沉淀不可能再重新溶解于水。 (2)由于沉淀过程发生了蛋白质的结构和性质的变化，所以又称为变性沉淀。 (3)如加热沉淀、强酸碱沉淀、重金属盐沉淀和生物碱沉淀等都属于不可逆沉淀。 五.蛋白质的变性 蛋白质的性质与它们的结构密切相关。某些物理或化学因素，能够破坏蛋白质的空间结构状态，引起蛋白质理化性质改变并导致其生理活性丧失。这种现象称为蛋白质的变性.,变性蛋白质通常都是固体状态物质，不溶于水和其它溶剂，也不可能恢复原有蛋白质所具有的性质