《核酸理化性质》PPT课件.ppt

1、第3节 核酸的理化性质,一 物理性质,DNA为白色纤维状固体; RNA为白色粉末状固体?,1、形态,2、溶解性,微溶于水，不溶于乙醇、乙醚和氯仿等一般的有机溶剂；DNA在溶液中粘度大，RNA粘度小。,核酸既含有酸性的磷酸基团，又含有弱碱性的碱基，故可发生两性解离。其解离状态随溶液的pH值而改变。,核酸的理化性质,3、两性解离,由于磷酸基团的酸性很强，所以pI较低，整个分子相当于多元酸。,利用核酸的两性解离可以通过调节核酸溶液的等电点来沉淀核酸，也可通过电泳分离纯化核酸。,嘌呤和嘧啶具有共轭双键，能强烈吸收紫外光。在260nm处有最大吸收峰。对于纯的DNA或RNA，可以通过测得A260来测定核酸

2、的含量。,纯的DNA：A260/ A280 =1.8 纯的RNA：A260/ A280 =2.0,二 紫外吸收性质,A260/ A280值可以反映核酸的纯度。,核酸的理化性质,核酸变性后，在260nm处的吸收值上升，这叫增色效应(hyperchromic effect)。增色效应常可用来衡量DNA变性的程度。,三 核酸的变性,核酸在某些物理或化学因素的作用下，其空间结构发生改变，从而引起理化性质的改变及生物活性的降低或丧失叫变性。引起变性的因素有：加热、酸碱、尿素、甲醛等。,1.增色效应,核酸的理化性质,DNA分子变性( DNA denaturation ), D.S. DNA,S.S. DN

3、A,( 加温, 极端pH, 尿素, 酰胺 ),变性过程的表现, S.S. DNA粘度降低, S.S. DNA 沉降速度加快, S.S. DNA分子的A 260 nm UV 值上升 ( Hyperchromicity ),热变性中光吸收达到最大吸收（完全变性）一半（双螺旋结构失去一半）时的温度称为DNA的熔点或熔解温度（Tm）。,2. 熔解温度,核酸的理化性质,三 核酸的变性,热变性曲线 (熔解曲线),图5-26 Tm的示意图,在DNA发生热变性的过程中，A260随温度的变化曲线。,核酸的理化性质,1.185,Concentration 50 g/mL,D.S DNA A260 = 1,S.S

4、DNA A260 = 1.37,dNTPs A260 = 1.60,Tm,= OD增加值的中点温度(一般为85-95),Tm值与DNA的均一性、G-C含量、介质离子强度、pH等因素有关。,核酸的理化性质,三 核酸的变性,Marmur-Doty Formula,Evaluation GC% of DNA,Tm1 Tm2,what is meaning ?,Tm = 69.3 + 0.41 GC%,l 增色效应的跳跃现象 ( Jump of Hyperchromicity ),高分子量的DNA分子在热变性过程中, 富含AT区域首先发生 变性, 然后逐步扩展, 表现增色效应的跳跃现象, 使变形过程加

5、快., 影响 Tm值的因素, 在 A, T, C, G 随机分布的情况下, GC%含量相同的情况下,GC%愈高 Tm值愈大,GC%愈低 Tm 值愈小,AT形成变性核心，变性加快，Tm 值小,碱基排列对Tm值具有明显影响（除变性核心外）,碱基堆积面 和 碱基积压程度的差异,例：常温下，活体内 D.S DNA分子中富含AT的变性 核心区（promoter, terminator region ） 常表现氢键的断裂与形成的 “DNA呼吸现象”,37.6 57 ,Tm,碱基排列对Tm值具有明显影响, 大片段D.S DNA分子之间比较,片段长短对Tm值的影响较小, 但与组成和排列相关, 小于100bp

6、的 D.S DNA分子比较,片段愈短， 变性愈快，Tm值愈小, 变性液中含有尿素，酰胺等, 盐浓度的影响,单链DNA主链的磷酸基团,负电荷的静电斥力,两条单链DNA的分离,Na+在磷酸基团周围形成的电子云 对静电斥力产生屏蔽作用,减弱静电斥力,Tm ,Tm ,pH 12,酮基 烯醇基,pH 2-3,NH2 NH3+ (质子化),改变氢键的形成与结合力,极端pH条件的影响,一切减弱氢键， 碱基堆积力的因素 均将使Tm 值降低,四 核酸的复性,1.复性 (renaturation),DNA水溶液加热变性时，双螺旋两条链分开；如果缓慢冷即，两条链可以完全重新结合成各原来一样的双股螺旋过程。,复性是变

7、性的逆转。但需要一定的条件，要在一定的盐浓度下缓慢降温。,核酸的理化性质,DNA 分子的复性 (anneal or renaturation),D.S DNA,S.S DNA,Denaturation , Renaturation,复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞 ( Depends on the collision of complementary S.S. DNA ),2. 减色效应(hypochromic effect),当变性的DNA经复性以重新形成双螺旋结构时，其溶液的A260值则减小，这种现象称为减色效应。,核酸的理化性质,四 核酸的复性,影响DNA复性过程的因素 ：, S.S,

8、 DNA 的初始浓度 C0, DNA 分子中, dNt 的排列状况 (随机排列, 重复排列),复性发生的过程讨论,遵循second order kinetics formula （二级反应动力学）,dCt / dt = -KCt2, 两条部分同源的S.S. DNA, 在复性过程中形成的部分 双链区是不稳定的, 单链DNA的随机碰撞 过程（ randomly collision ）,dCt / dt = -KCt2 积分,Ct / C0 = 1 / 1+KC0t,当 Ct / C0 = 1/2 时,Ct / C0 = 1/2 = 1 / 1+ KC0t(1/2),K = 1 / Cot(1/2)

9、,Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L), 不同的DNA Cot 是不同的， Cot 不但与K值有关，也与DNA的复杂性有关； K值取决于阳离子浓度、温度、片断大小及DNA分子复杂性； 如果将其它因子固定，则K与复杂性X的关系为： K=1/X, 所以， Cot =1/K =X：,Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L), 复杂性(X)-DNA中没有重复碱基的排列顺序的数值。 e.g. (A)n, X =1; (AT)n, X =2; (AGC)n, X =3; (AGCT)n, X =4; (AGCTG)n, X =5; Cot 代表DNA顺序的复杂程度。

10、,Cot(1/2) = 1/K (mol. Sec / L),3. 分子杂交 (hybridization),核酸的理化性质,四 核酸的复性,不同来源的单链DNA与单链DNA RNA与 单链DNA分子间 在长于20 bp的同源区域内 以氢键连接方式互补配对 形成稳定的双链结构的过程,3. 分子杂交 (hybridization),核酸的理化性质,四 核酸的复性,DNA链在复性时，其中的一条单链可以内异体DNA单链，按照碱基互补原则合成一段DNA-DNA或DNA-RNA双链的过程。,3. 分子杂交 (hybridization),核酸的理化性质,四 核酸的复性,杂交检测,D.S. DNA,X-f

11、ilm,Column absorb D.S DNA,p32 or biotin labeled,S.S. DNA ( as probe), S.S. DNA,种类, 液相分子杂交,Absorb D.S. DNA,1975 E. M. Southern,1977. J.C. Alwine,1978. Hany Towbin, 原位分子杂交 (In situ hybridization ),Southern blot,Northern blot,Western blot,S.S. DNA S.S. DNA,S.S. RNA S.S. DNA,Protein antibody,五 DNA 一 级 结

12、 构 分 析 （DNA sequencing ）,1972. Herbert Boyer 限制性核酸内切酶II (RE-II),Sanger C. “ , ” 法,Maxam Gilbert 化学定序法,Sanger C. ddNTP(酶)法,1. 历史,(1) Chemical sequencing,G系统； pH 8.0 硫酸二甲酯 G m7G C8N9断裂 脱G,A+G系统；pH 2.0 哌啶甲酸（pidine） 嘌呤环 N质子化 脱嘌呤,C系统； 1.5 mol/L NaCl C + 肼（hydrazine） 脱C,T + C系统； 肼(hydrazine) 打开嘧啶环 重新5C环化脱嘧啶,2. 方法,Chemical sequencing,(2) 双脱氧法,4ddNTP系统中 DNA链均终止 在ddNTP(二脱氧核苷酸),六 DNA的甲基化（Methylation） (m5C in Eukaryote),m5C,1. DNA中m5C的特点,CH3,修饰核糖右下角：Am 碱基左上角：m22,7G,举例 . a. DNA m5dC 5-甲基脱氧胞苷； m6dA N6-甲基脱氧腺苷； n2dA 2-氨基脱氧腺苷。,2. 甲基化的方式,b. RNA m1A 1-甲基腺苷 m6A N6-