动物组织核酸的分离、鉴定和含量测定.ppt

1、动物组织基因组DNA的分离纯化及鉴定,1. 猪肝基因组DNA分离 2. 核酸的定量和纯度测定 3. 脱氧核糖的显色实验,核酸是一类生物高分子化合物，存在于一切生物体内，是组成细胞的重要成分。它以与蛋白质结合的形式-核蛋白存在于细胞中，是生命的基本物质之一，具有储存、复制生物体遗传信息的功能，也是蛋白质合成不可缺少的物质，因此它对于生物体的生长、遗传、变异等现象起着重要的决定作用 核酸分为两大类-核糖核酸(RNA)和脱氧核糖核酸(DNA) 核酸完全水解产生嘌呤和嘧啶等碱性物质、戊糖（核糖或脱氧核糖）和磷酸的混合物 核酸部分水解则产生核苷和核苷酸。每个核苷分子含一分子碱基和一分子戊糖，一分子核苷酸

2、部分水解后除产生核苷外，还有一分子磷酸 核酸的各种水解产物可用层析或电泳等方法分离鉴定,DNA和RNA的结构,基因组DNA的提取通常用于构建基因组文库、Southern杂交(包括RFLP)及PCR分离基因等。 利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得

3、到较长的DNA。 不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。,1. 猪肝基因组DNA的分离,核酸分离的原则 在溶解细胞的基础上，利用有机溶剂抽提蛋白质（核酸溶于缓冲液，即水相），分离，纯化；利用乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀核酸，收获,核酸分离的一般步骤,1 溶解细胞 溶解细胞的方法因样品不同而不同，如十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate,SDS）加EDTA法、蛋白酶消化法、强碱法、超声破碎加冻融等。 2 有机溶剂抽提 苯酚使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在水相，达到分离核

4、酸的目的。 3 纯化 为了得到纯的核酸，可用蛋白酶除去蛋白；用RNA酶除去RNA，得到纯的DNA；用DNA酶除去DNA，得到纯的RNA。 4 沉淀 为了除去分离过程中残留的有机溶剂，常用的方法是加冷乙醇和盐沉淀核酸，再通过离心回收核酸，然后用70%-80%乙醇洗涤沉淀，除去多余的盐，以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应。,核酸分离试剂盒: 可简单、快速地分离得到纯度很高的DNA或RNA，其分离原理是在特定溶液环境下（高盐、低pH)使核酸吸附在固相介质（一般是硅胶膜）上，洗涤去除杂质后，再改变溶液环境使DNA溶解到纯水或TE中，以达到分离、回收核酸的目的。,盐溶法分离DNA和RNA的原理,根

5、据RNA与DNA在一定浓度的氯化钠溶液中的溶解度不同进行分离： 在0.14M的氯化钠溶液中，RNA核蛋白溶解度大，而DNA核蛋白溶解度小；相反在1M的氯化钠溶液中，DNA核蛋白的溶解度大，而RNA核蛋白的溶解度小，从而使DNA和RNA核蛋白分开。 然后用蛋白质变性沉淀剂去除蛋白，使核酸释放出来，再利用核酸不溶于乙醇的性质将核酸析出，达到分离DNA和RNA的目的。,酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提,酚：有效的使蛋白质变性，不能完全抑制RNA酶的活性，能溶解带有长poly(A)的RNA分子。使用前必须用水饱和并用Tris平衡至pH7.8，以防止DNA分配到有机相。 氯仿：强烈的脂溶性，去除脂

6、类杂质，增加有机相比重。纯酚的比重为1.07，有机相和水相有时很难分开。加入氯仿（比重为1.47）可以避免这一问题。同时，酚有时会微溶于水，可以用氯仿将水相中的酚去除。 异戊醇：降低表面张力，减少气泡产生，使离心后的水相、变性蛋白相及有机溶剂相维持稳定。,实验步骤,1.2g,挤干乙醇后加1mlSC液溶解,2. 核酸的定量和纯度测定,紫外分光光度法: 定量： 260nm下，1OD相当于50ug/ml双螺旋DNA， 40ug/ml 双链RNA 检测纯度：纯的DNA A260/A280=1.8，RNA为2.0，样品中含有蛋白质和苯酚时， A260/A280 比值降低。 定糖法: DNA糖部分为脱氧核

7、糖，RNA糖部分为核糖，分别可以进行二苯胺显色法和地衣酚显色法 定磷法: 测定核酸的磷酸部分,实验方法,1ml SC溶液溶解DNA， 8000rpm离心5分钟后，将上清转移到5ml离心管中，用1ml 0.01M NaOH溶液加入沉淀中，使其充分溶解，并再次离心5分钟，上清与第一次溶解液合并备用 A260测定：以SC溶液作为空白，取上清测A260值（OD3.0即在测量范围之内），并计算DNA浓度（1OD=50mg/ml DNA） A280测定： A260/A280比值计算。纯的DNA为1.8，RNA为2.0。如果样品中混有RNA，则比值大于1.8；如果样品中混有蛋白质，则比值小于1.8 若A26

8、0/A280比值较为正常，则可确定二苯胺法测量DNA浓度的粗略稀释倍数，使A260值在2.0左右（DNA浓度约为100ug/ml）,3. 脱氧核糖的显色实验,加热条件下： RNA浓盐酸地衣酚 绿色 DNA酸二苯胺 蓝紫色,二苯胺显色法原理,DNA在酸性条件下加热，其嘌呤碱与脱氧核糖间的糖苷键断裂，生成嘌呤碱、脱氧核糖和脱氧嘧啶核苷酸，而2-脱氧核糖在酸性环境中加热脱水生成w-羟基-g-酮基戊糖，与二苯胺试剂反应生成蓝色物质，在595nm波长处有最大吸收。DNA在40400mg范围内，光吸收与DNA的浓度成正比。在反应液中加入少量乙醛，可以提高反应灵敏度。,DNA标准曲线的制作和样品测定,注：待测溶液中的DNA含量应调整至标准曲线的可读范围内。 样品1和样品2为不同稀释倍数的DNA溶液 二苯胺法的测定范围是40-400 ug/ml DNA，浓度太小会影响测定结果,以DNA的含量为横坐标，光密度（吸收值）为纵坐标，绘制标准曲线。,DNA含量计算,根据标准曲线,以样品的光密度计算出相应DNA含量,并同紫外法测