植物病理学研究方法第4-5章课件.ppt

1、2020/9/11 吉林农业大学,1,植物病理学基础研究方法 （第4章细菌病害研究技术）,2020/9/11 吉林农业大学,2,第4章 细菌病害研究技术,Erwin Frink Smith (18541927) 美国植物病理学家，植物病原细菌学奠基人。1854年 1月21日生于美国纽约， 1927年4月6日卒于华盛顿。 史密斯从1892年起开始从事细菌病害的研究。1895年首次发表了关于瓜类萎蔫病的研究论文。曾对果树根癌病、甘兰黑腐病和茄科植物青枯病等进行过系统研究。 在19世纪末到20世纪初同德国细菌学家A.菲舍尔在细菌是否引起植物病害的问提上，进行了长达10年的激烈论战，并以大量的事实和研

2、究成果赢得了论战的胜利， 从而进一步推动了植物细菌性病害的研究。 1903年出版世界上第一本关于植物细菌病害的专著细菌与植物病害的关系第卷。 国际细菌学分类和命名委员会以他的名字作为植物病原周毛杆菌属的命名，即欧文氏杆菌属(Erwinia)。,Erwin Frink Smith (18541927),2020/9/11 吉林农业大学,3,第四章 细菌病害研究技术,第一节 病原细菌的分离、纯化、培养和 菌种保存 第二节 细菌的接种 第三节 病原细菌的鉴定,2020/9/11 吉林农业大学,4,第一节 病原细菌的分离、纯化、培养和菌种保存,一.病原细菌的分离 二.病原细菌的纯化 三.病原细菌的培养

3、 四.病原细菌的菌种保存,2020/9/11 吉林农业大学,5,一.病原细菌的分离,植物病原细菌的分离方法 主要有划线分离法和稀释分离法二种。 最常用的方法是划线分离法。,2020/9/11 吉林农业大学,6,(一)划线分离法,1.事先准备 无菌操作室或清洁安静的房间，超净工作台等。 分离材料：要选择新鲜的分离材料。 培养基：NA培养基等。 分离器皿及工具： 无菌培养皿、无菌吸管、无菌玻璃涂棒、剪刀、解剖刀、镊子、接种环、70%酒精、0.1%升汞、酒精灯、火柴、玻璃铅笔、橡皮筋套、微波炉等。 无菌水：盛于三角瓶或试管中。,2020/9/11 吉林农业大学,7,2. 操作步骤,倒平板 切取病组织

4、 表面消毒 无菌水洗3次 制备菌悬液 平板上划线 25培养 选择单菌落移入斜面 25培养 检查斜面上分离菌 保存菌种,培养后 细菌长出,选择单菌落,移入斜面画蛇行线,保存菌种,划线,24小时培养后,可见菌落,2020/9/11 吉林农业大学,8,划线分离法-要形成单菌落,火焰上烧去接种环上 的细菌悬液,2020/9/11 吉林农业大学,9,3.注意事项, 要选择新鲜的分离材料， 如果材料上腐生菌多，应重新接种， 发病后再用于分离。 分离细菌的表面消毒时间应少于分离真菌， 如用0.1升汞消毒时间应为0.5min或再少些。也可用更温和的表面消毒剂，如70%酒精等。 如果分离材料很新鲜，也可不进行表

5、面消毒，用无菌水洗3次即可。,2020/9/11 吉林农业大学,10,注意事项, 分离细菌时选择性培养基经常应用。 Erwinia属 可用MS或CVP； Xanthomonas 属可用YDC; Pseudomonas 属中带荧光者可用KB， 不带荧光者用NBY 1000mL中加入TTC(三苯基四唑化氮)1溶液5mL; Agrobacterium属 用D1培养基。 G+ 各属可用1/万重铬酸钾（钠）抑制G-， 加一些天门冬酰胺利于G+生长。,2020/9/11 吉林农业大学,11,注意事项, 使用的NA培养基等灭菌后易偏酸，而细菌喜硷性，可适当调节pH。 对分离菌菌落不了解时，分离时要选择优势菌

6、落移入斜面。 如果无优势菌落，则要重新分离或将各种菌落都分离出来，再进一步选择。,2020/9/11 吉林农业大学,12,(二) 稀释分离法,1.事先准备 大体同划线分离法,(二) 稀释分离法,2.操作步骤（大体同真菌） 切取病组织 表面消毒 无菌水洗3次 制备菌悬液 稀释 用约50培养基倒平板 25培养 选择优势单菌落移入斜面25培养检查斜面上分离菌 保存菌种,2020/9/11 吉林农业大学,14,稀释分离法示意图,2020/9/11 吉林农业大学,15,两种稀释分离法示意图,稀释倒平板法,涂布平板法,2020/9/11 吉林农业大学,16,二.病原细菌的纯化,方法： 利用稀释分离法、划线

7、分离法等 重新进行分离， 待同一平板上的菌落性状达到全部一致， 再移殖其中单菌落到斜面培养基 就认为菌种得以纯化。,2020/9/11 吉林农业大学,17,病原细菌的纯化,待同一平板上的菌落 性状达到全部一致, 再移殖其中单菌落 到斜面培养基, 就认为菌种得以纯化.,2020/9/11 吉林农业大学,18,病原细菌的致病性测定：,一般在细菌获得分离后，紧接着就应对其进行致病性的测定工作。 如果我们分离的菌株并非致病菌，则使用这种菌株继续进行研究只会白白浪费时间。 致病性的测定方法： 将分离菌接种于其健康的寄主植物，如可致病，则致病性获得确认。,2020/9/11 吉林农业大学,19,简易的致病

8、性测定方法：过敏反应测定,还有一种简易的致病性测定方法， 即进行该细菌的过敏反应测定。 常用方法为：配制此细菌菌悬液（浓度：108-9 cfu/mL ） 简易判断此浓度的方法：在盛有菌悬液的试管后面放一张报纸，可分辨出字块，但无法辨认出字形时，大体为此浓度。 注射到普通烟草叶（脉）片中，经过24h（气温在2025），如菌悬液扩散所到处变成褐色，即为过敏反应阳性，表明其为致病菌。 这种方法并非100可靠，但可对分离出来的多个菌株进行初筛。,cfu（colony forming unit） 通常称为“可形成菌落单元”， 用于表示细菌的数目， 它和细菌的个数正相关。,2020/9/11 吉林农业大学

9、,20,烟草过敏反应：在确定分离的细菌有无致病性时采用,马铃薯环腐病菌、梨火疫病菌在烟草上 引起过敏性坏死反应 (HR),过敏性反应,2020/9/11 吉林农业大学,21,三.细菌的培养,在获得了细菌的分离物后，通常要进行细菌的培养， 即将病原菌移植于固体或液体培养基上，使其生长，并观察记载该菌在该培养基及特定培养条件(温度、光照、pH等)下的培养性状。 包括其形态、颜色、表面特征、生长速度、色素的分泌、气味、某些特定化合物的生成等。 研究培养性状有助于我们对微生物的鉴别，也可以研究培养基成分及培养条件对该微生物生长发育的影响。,2020/9/11 吉林农业大学,22,1.固体培养基上的培养

10、性状观察,让某种细菌在平板培养基上形成单个菌落或在斜面培养基上形成菌苔。观察、记载以下内容： 菌落（苔）颜色、 形状（特别是边缘的形状）、 表面是否凸起或凹陷、 表面是否光亮、 是否有色素分泌出来而渗透到培养基中、 生长速度快慢等。 同时要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。 一般常用NA培养基，在2530培养。,2020/9/11 吉林农业大学,23,在固体培养基中的生长情况： 在平板上形成菌落，在斜面上形成菌苔,在斜面上 画直线,2020/9/11 吉林农业大学,24,在平板培养基上形成菌落,罗氏培养基,2020/9/11 吉林农业大学,25,细菌菌落与真菌菌落的区别,霉菌的

11、菌落较大，有的霉菌菌落可扩展到整个培养皿，有的种则有一定的局限性。菌落呈现或紧或松的蛛网状、绒毛状或棉絮状；菌落与培养基的连接紧密，不易挑取；菌落正反面的颜色和边缘与中心的颜色常不一致。 细菌菌落常表现为湿润、粘稠、光滑、较透明、易挑取、质地均匀以及菌落正反面或边缘与中央部位颜色一致等。细菌的菌落特征因种而异。,2020/9/11 吉林农业大学,26,放线菌菌落,放线菌在固体培养基上形成与细菌不同的菌落特征，放线菌菌丝相互交错缠绕形成质地致密的小菌落，干燥、不透明、难以挑取，当大量孢子覆盖于菌落表面时，就形成表面为粉末状或颗粒状的典型放线菌菌落，由于基内菌丝和孢子常有颜色，使得菌落的正反面呈现

12、出不同的色泽。,2020/9/11 吉林农业大学,27,2.液体培养基上的培养性状观察,让某种细菌在液体培养基中生长数d后观察、记载以下内容： 液体培养基表面菌膜颜色、表面特征、 是否生成沉淀、产酸产气、 是否有色素分泌、 生长速度快慢等。 同时要记载培养基种类(成分及pH)和培养温度、光照条件。,2020/9/11 吉林农业大学,28,细菌在液体培养基中的生长情况,多数呈均匀 混浊状态,少数链状菌 呈沉淀生长,专性需氧菌则在表面 生长，常形成菌膜,菌膜,2020/9/11 吉林农业大学,29,液体培养基上的培养性状观察,产气,生成沉淀,表面菌膜,2020/9/11 吉林农业大学,30,在半固

13、体培养基中的生长情况： 常用于观察细菌动力,有鞭毛的细菌可沿穿刺线 呈羽毛状或云雾状混浊生长,无鞭毛细菌则只能沿穿刺线呈明显的线状生长,2020/9/11 吉林农业大学,31,四.细菌菌种的保存,（一）菌种保存的目标 细菌菌种保存的目标、方法和真菌大同小异。 菌种保存的目标是： 不会因贮藏条件不妥而死亡， 不因保存方法不当而发生变异， 不被其他生物污染。 为此目标， 通常采用抑制病原物代谢活动的方式以延长其存活并减少变异，如放置于低温、干燥、缺氧条件下。 或将其培养基养分降低到原来的1/2。,2020/9/11 吉林农业大学,32,（二）常用保藏方法,1.室温保存 许多细菌的斜面培养，只要放在

14、温度变化不大的室温即可。室温保存缺点是培养基易干燥，要及时移植。 2.低温保存 将菌种棉塞部分用油纸包好，置28的冰箱中保藏。是最常用的保存菌种的方法。为防止培养基干燥，每3-4周即要移植一次。而黄单胞菌及G+ 各属1-2周即应移殖。黄单胞菌产酸多，培养基中可加入2碳酸钙粉以降低pH或用YDC培养基保存。 如放在20或80冰箱中及液氮罐中，则存活期可以更长。,2020/9/11 吉林农业大学,33,常用保藏方法,3.石蜡油保存 利用灭菌的矿物油(液体石蜡)灌在斜面菌种的表面，其高度超过斜面顶部1cm，以隔绝菌种与空气接触。无芽孢的细菌也可保存一年左右。 4.灭菌蒸馏水悬浮保存 很多细菌可采用蒸

15、馏水保存法，即把细菌悬液放在灭菌蒸馏水小管中，加橡皮塞密封后置室温下，是较好的保存方法。 5.冷冻真空干燥保存法(冻干保存法) 绝大多数的细菌均可采用冻干法长期保存。 冷冻干燥保藏法的步骤包括两部分，即首先在极低温度下(70左右)快速冷冻，然后在极低温度下真空干燥。这样可使细胞的结构与成分保持原来的状态。,2020/9/11 吉林农业大学,34,细菌的计数,血球计数板法 混浊度计数法 分光光度计 麦法兰云度计 稀释平板法 制片显微计数法,2020/9/11 吉林农业大学,35,细菌的计数,血球计数板法 使用方法同真菌孢子计数法一样。 适用范围： 个体较大细胞或颗粒，如血球、酵母菌等。不太适用于

16、细菌等个体较小的细胞。 因为 （1）细菌细胞太小，不易沉降； （2）在油镜下看不清网格线，超出油镜工作距离。 针对这些问题，可以采用高倍镜观察，分层观察的方法。,2020/9/11 吉林农业大学,36,混浊度计数法,分光光度计： 由于细菌悬液浓度越大则消光度越大， 因此可制定细菌悬液浓度与消光度关系的标准曲线，用分光光度计测定细菌数目。 麦法兰云度计： 将1Bacl2和1H2SO4按不同比例混合， 形成数量不同的BaSO4细微颗粒悬浮在液体中， 其混浊度和细菌的不同浓度相对应。 这两种方法都可以测定细菌的数量。 但，植物组织中的色素也会影响消光度，所以测定植物组织中的细菌数量时要注意数据校正。

17、,2020/9/11 吉林农业大学,37,稀释平板法,稀释平板法的大体做法为： 将菌悬液进行适当稀释（使其在平板培养基上可以生长出10-30个的菌落为适）， 置灭菌培养皿内和约50的培养基均匀混合，凝成平板。 在25培养数d，待平板上长出菌落后， 根据目标菌菌落特征计算出平均每个平板上的菌落数，再乘以总的稀释倍数， 即可得出菌悬液中的细菌数。,2020/9/11 吉林农业大学,38,稀释平板法,2020/9/11 吉林农业大学,39,制片显微计数法,做法： 将菌悬液在载玻片的画定的小区域内涂抹均匀，不让细菌菌体重叠，过酒精灯火焰固定菌体，并进行染色。 在显微镜下观察30个视野，查得每视野内细菌

18、平均数。 根据画定的小区域面积和显微镜视野面积的比值计算，得出小区域内细菌数目，即可得出菌悬液中的细菌数。,2020/9/11 吉林农业大学,40,第二节 病原细菌的接种,接种体的准备 常用接种方法 接种后的观察记载,2020/9/11 吉林农业大学,41,接种体的准备,1.利用保存的病组织 对于接种仅为了引起寄主植物发病，而不为了精确测定致病性时可以采用此法。 黄瓜细菌性角斑病干燥病叶保存于室内越冬后， 次年春季将病叶捣碎浸泡于10-30倍重量的水中1h，滤出病叶残体，即可用于接种。 水稻白叶枯病叶切成小段，加入约10倍重量的水，浸泡1-2h，纱布过滤后得到菌悬液，即可用于接种。,2020/9/11 吉林农业大学,42,接种体的准备,2. 利用人工培养基培养 采用斜面或平板培养基：NA等培养基。 采用适当的培养时间 通常培养时间在48h较好。 时间过短，细菌菌体数量太少， 时间过长则细菌致病力减退。,2020/9/11 吉林农业大学,43,接种体的准备, 菌悬液的浓度： 通常菌悬液的浓度为1107-8c