氨基酸及蛋白质的分离.ppt

1、氨基酸混合物的分析分离,氨基酸的分析分离工作是测定蛋白质结构的基础，分离和定量测定蛋白质水解液中的各种氨基酸是一项艰巨的任务。 层析是利用混合物中各组分的理化性质的差别，使各组分以不同程度分配在两相（固定相和流动相）中，并使各组分以不同速度移动，从而达到分离。,分配层析的一般原理,层析即色层分析又称“色谱”(chromatograghy）。 固定相(静相): 固相/液相/固-液混合相 流动相(动相): 液相/气相 Kd=CA / CB 其中: Kd-分配系数 CA-某物质在A相(动相)中的浓度 CB-某物质在B相(静相)中的浓度 一般混合物中各成分的分配系数差异越大, 越容易分离。,层析系统,

2、A. 逆流分溶（逆流分配）,Kd=1,Kd=3,B 分 配 柱 层 析,纤维素、淀粉、硅胶等,茚 三 酮显色定量,C. 纸层析：常用于氨基酸混合物的分离、鉴定,单向纸层析图,Rf值,双向纸层析图,D 薄 层 层 析,纤维素粉、硅胶、氧化铝等,E. 离子交换层析,原理：分离氨基酸时，用离子交换树脂作为支持物，利用离子交换树脂上的活性基团与溶液中的离子进行交换反应。由于各种离子交换能力不同，与树脂结合的牢固程度就不同，在洗脱过程中，各种离子以不同的速度移动，从而达到分离的目的。 这种分离主要与各种离子所带电荷有关，在电荷相同时，与极性，非极性有关。,阳离子交换树脂：活性基团是酸性的，如磺酸基 -S

3、O3H（强酸型），羧基-COOH（弱酸型）,阴离子交换树脂：活性基团是碱性的，如季胺基 -N+(CH3)3OH-,分离氨基酸混合物常用强酸型阳离子交换树脂。,在pH3左右，氨基酸与阳离子交换树脂之间静电吸引大小次序为： 碱性氨基酸(A2+) 中性氨基酸(A+) 酸性氨基酸(A) 氨基酸的洗脱顺序为：酸性氨基酸、中性氨基酸、碱性氨基酸。,F. 高效液相色谱 ( high performance liguid chromatography， HPLC ),分辨率高,洗脱速度快,蛋白质的性质和分离纯化,蛋白质的性质 蛋白质的酸碱性质 蛋白质分子的大小与形状 蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 蛋白质的颜

4、色反应,蛋白质的分离纯化及含量测定 蛋白质分离纯化的一般原则 蛋白质分离纯化的步骤 蛋白质分离纯化的方法 蛋白质含量的测定,蛋白质分离纯化的目的 1.研究蛋白质的分子结构； 2.研究蛋白质的生物功能； 3.蛋白质的应用。 蛋白质分离纯化的方法 利用各种蛋白质的性质差别。,蛋白质的性质 1. 蛋白质的酸碱性质,蛋白质为两性电解质 蛋白质等电点(pI) pHpI, 蛋白质带正电荷; pHpI 带负电荷; pH = pI时为两性离子。 蛋白质溶液处于等电点时，溶解度最小；粘度、渗透压、膨胀性及导电能力也降为最低值。,蛋白质的两性解离和等电点,蛋白质在等电点的溶解度最小,等离子点： 指在没有其他盐类干

5、扰时，蛋白质质子供体基团解离出的质子数与质子受体基团结合的质子数相等时的pH, 为蛋白质特征常数。,蛋白质相对分子质量(Mr)在60001 000 000之间。 测定蛋白质相对分子质量的主要方法 化学组成法 渗透压法 超离心法（沉降分析法） 凝胶过滤法 聚丙烯酰胺凝胶电泳等。,2. 蛋白质分子的大小及其形状,元素(分子)分子量 最低Mr = 元素(分子)百分含量 例如: Mb Fe原子量(55.8 ) 最低Mr = Fe元素百分含量 (0.335%) =16700,(一) 化学组成法测定最低Mr,(二) 沉降速度法测定蛋白质Mr,蛋白质在离心场中沉降时: Fc(离心力) = mp2 Fb(浮力

6、) = Vp2 = mp2 Ff(摩擦力) = fv = f(d/dt) 通过测定沉降界面的移动速度测定Mr. dx/dt 为常数时: Fc - Fb = Ff (d/dt) mp（1-） 2 f,沉降系数：单位离心力场的沉降速度叫沉降系数，用s 表示。 s=(dx/dt)/2= mp(1-)/f 沉降系数只与分子的大小和形状有关，当分子形状相似时，s与Mr成正比。因此s常用作生物大分子的大小表示方法。 由于s值较小，因此用110-13秒表示1个沉降系数单位（ Svedberg unit）。S值与温度和溶剂有关，故一个分子的沉降系数定义为20，水溶液条件下的s值为标准。 1S = 110-13

7、（s）,由于蛋白质分子的沉降速度同时受到分子的大小和形状的影响，大小与质量有关、而形状与其扩散系数有关： mp = Mr/N f = RT/ND s = mp(1-)/f,凝胶是由胶体溶液凝结而成的固体物质。其内部具有很细微的多孔网状结构。 凝胶层析的机理是分子筛效应, 即可以把物质按分子大小不同进行分离, 但这种“过筛”与普通的过筛不一样。 在洗脱过程中，大分子不能进入凝胶内部而沿凝胶颗粒间的空隙最先流出柱外，而小分子可以进人凝胶颗粒内部的多孔网状结构，流速缓慢，以致最后流出柱外，从而使样品中分子大小不同的物质得到分离。,(三) 凝胶过滤法测定蛋白质Mr,分子筛层析的工作原理,凝胶过滤层析

8、(分子排阻),logMr = k + cve Ve：为实际测得的洗脱体积(即自加样至组分洗脱峰出现时流出的体积),交联葡聚糖Sephadex G-50 ( 1 500 30 000 ) G-75 ( 3 000 80 000 ) G-100 ( 4 000150 000 ),(四) SDS-PAGE测定蛋白质Mr,SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂，可破坏蛋白质氢键和疏水作用使蛋白质变性。 SDS带有很多负电荷，与蛋白质结合（1.4克SDS/1克蛋白质）后，SDS的负电荷远远超过了蛋白质分子原有的电荷，蛋白质分子原有的电荷就变得无足轻重了，所以在电场上移动的速度完全取决于蛋白质分子的大

9、小。 在SDS和巯基乙醇存在下，蛋白质和亚基的肽链完全伸展成长棒状（1.8nm），其分子量与肽链的长度成比例。,3. 蛋白质的胶体性质,具有胶体的一切特性（布朗运动、丁达尔现象、不能透过半透膜、具有吸附能力） 亲水胶体稳定性 ： （1）直径1-100nm; （2）水化层 （3）双电层 溶胶( 蛋白质颗粒分散在水中）、凝胶( 水分散在蛋白质颗粒中）,4. 蛋白质的沉淀,消除稳定蛋白质的因素, 就会导致蛋白质沉淀。通常进行蛋白质沉淀的方法有以下几种： 1. 盐析法 2. 有机溶剂沉淀法 3. 重金属盐沉淀法 4. 生物碱试剂和某些酸沉淀法 5. 热变性沉淀法,可以使蛋白质不变性,通常会使蛋白质变性

10、,(一) 蛋白质的盐析,中性盐对球状蛋白的溶解度有显著的影响： 盐溶：低浓度的中性盐可增加蛋白质的溶解度。 盐析：高浓度的中性盐，如饱和(NH4)2SO4使蛋白质溶解度下降，从溶液中沉淀析出。 分段盐析：调节盐浓度，可使混合蛋白质溶液中的几种蛋白质分段析出. 鸡蛋清中球蛋白（50%(NH4)2SO4饱和度），清蛋白（饱和(NH4)2SO4)。,蛋白质的盐析,(二) 有机溶剂沉淀法,向蛋白质溶液中加入一定量的极性有机溶剂(甲醇、乙醇或丙酮等),因引起蛋白质脱去水化层及降低介电常数而增加带电质点间的相互作用,致使蛋白质颗粒容易凝集而沉淀。 如果控制在低温下操作且尽量缩短处理的时间则可以使变性速度间

11、慢。,(三) 重金属盐沉淀法,当溶液pHpI，蛋白质颗粒带负电荷，容易与重金属离子(Hg2+、Pb2+、Cu2+、Ag+等）结合成不溶性盐而沉淀。 重金属盐水解生成酸或碱，可使蛋白质变性。,(四) 生物碱试剂和某些酸沉淀法,生物碱试剂：指能引起生物碱沉淀的一类试剂，如: 鞣酸(单宁酸)、苦味酸(2,4,6-三硝基酚)、钨酸、KI。 某些酸类：三氯乙酸(TCA)、磺基水杨酸和硝酸。 当溶液pHpI时，蛋白质颗粒带正电荷，与上述试剂的酸根负离子发生反应生成不溶性盐而沉淀。,(五) 热变性沉淀法,几乎所有的蛋白质都因加热变性而凝固。 少量盐类促使蛋白质加热凝固。 当蛋白质处于等电点时，加热凝固最完全

12、和最迅速。 原因：,热变性 破坏了蛋白质天然结构疏水基外露 破坏水化层,蛋白质处于等电点 破坏蛋白质带电状态,蛋白质沉淀,蛋白质分子的大小 蛋白质溶解度 蛋白质电荷状况 蛋白质吸附性质 蛋白质生物学亲和性,3. 蛋白质分离纯化的方法依据性质,依据分子大小不同的纯化方法,(一) 透析和超滤 透析：利用蛋白质不能透过半透膜的性质,分离无机盐、单糖等小分子。 超滤：利用压力或 离心力分离无机盐、单糖等小分子。,透析示意图,(二) 密度梯度离心 蔗糖 1.28g/cm3 聚蔗糖（Ficoll）,4% 8% 12% 16% 20%,蔗糖密度梯度,质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降的快,(三) 凝

13、胶过滤 也称分子排阻层析、分子筛层析，这是根据蛋白质分子大小不同来分离纯化蛋白质的一种方法。,(一) 盐析法 在蛋白质的抽提液中加入一定量的中性盐，使蛋白质沉淀下来。常用的中性盐为(NH4)2SO4、NH4Cl等。 中性盐对球状蛋白的溶解度有显著的影响： 盐溶：低浓度的中性盐可增加蛋白质的溶解度。 盐析：高浓度的中性盐，如饱和(NH4)2SO4使蛋白质溶解度下降，从溶液中沉淀析出。,依据溶解度差别的纯化方法,在蛋白质的盐析中，通常采用的中性盐有硫酸铵、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、氯化钠和磷酸钠等，其中以硫酸铵最为常用。 因为硫酸铵在水中的溶解度大而且温度系数小(在25 时，溶解度为767gL；0时

14、，溶解度为697gL)不影响酶的活性，分离效果好，而且价廉易得。 然而用硫酸铵进行盐析时，缓冲能力较差，而且铵离子的存在会干扰蛋白质的测定，所以有时也用其他中性盐进行盐析。,（二）有机溶剂沉淀法 常用的是乙醇、丙酮。能使蛋白质在水中溶解度降低： 改变介质的介电常数 与蛋白质争夺水化水 聚乙二醇：脱去蛋白质的水化层,（三）等电点沉淀法 利用两性电解质在等电点时溶解度最低, 以及不同的两性电解质有不同的等电点这一特性, 通过调节溶液的pH值, 使蛋白质或酶或杂质沉淀析出，从而使酶与杂质分离的方法。 当溶液的pH值等于溶液中某两性电解质的等电点时, 该两性电解质分子的净电荷为零, 分子间的静电斥力消

15、除, 使分子能聚集在一起而沉淀。 (四) 温度对蛋白质溶解度的影响,(一) 电 泳 带电颗粒在电场中移动的现象。分子大小不同的蛋白质所带净电荷密度不同，迁移率即异，在电泳时可以分开。 自由界面电泳：蛋白质溶于缓冲液中进行电泳。 区带电泳：将蛋白质溶液点在浸了缓冲液的支持物上进行电泳，不同组分形成带状区域。,依据电荷状况分离蛋白质,区带电泳按其支持物的物理性质不同可分为: （1）纸电泳、薄膜电泳：用滤纸、薄膜作支持物。 （2）粉末电泳：淀粉、纤维素粉作支持物。 （3）凝胶电泳：用凝胶（聚丙烯酰胺、琼脂糖）作支持物。 a) 圆盘电泳(disc)：玻璃管中进行的凝胶电泳。 b) 平板电泳（水平式、垂

16、直式）：铺有凝胶的玻板上进行的电泳。,1708年Reuss的实验,1930年Tiselius的装置,最早的电泳装置,根据其有无浓缩效应， PAGE分为连续系统与不连续系统两大类： 连续电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下, 主要靠电荷及分子筛效应. 不连续电泳体系中，由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分离效果更好。 不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶组成，两层玻璃板中排列顺序依次为上层浓缩胶、下层分离胶。,聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳(disc)示意图,测定分子量 纯度鉴定,SDS-聚丙

17、烯酰胺凝胶电泳 (SDS- PAGE),等电聚焦(IEF),等电聚焦电泳：利用两性电解质(ampholine)在凝胶中建立pH梯度，当蛋白质移动到其等电点时pH ，净电荷为零，在电场中不再移动。,(二) 离子交换层析,离子交换层析是利用离子交换剂上的可解离基团(活性基团)对各种离子亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。 离子交换剂是含有若干活性基团的不溶性高分子物质。通过在不溶性高分子物质(母体)上引入若干可解离基团(活性基团)而制成。 按活性基团的性质不同，离子交换剂可以分为阳离子交换剂和阴离子交剂。,由于蛋白质分子具有两性性质，故离子交换层析可根据蛋白质所带电荷的不同进行分离纯化。常

18、用的阳离子交换剂为羧甲基纤维素(CM-C)，阴离子交换剂为二乙基氨基乙基纤维素(DEAE-C)。 在溶液的pH值蛋白质的pI时，蛋白质分子带负电荷，可用阴离子交换剂进行层析分离；而当溶液pH值蛋白质的pI时，蛋白质分子带正荷，则要采用阳离子交换剂进行分离。,按母体物质种类的不同，离子交换剂有离子交换纤维素，离子交换凝胶（葡聚糖、琼脂糖、聚丙烯酰胺等）等。 引入的活性基团，可以是酸性基团，如磺酸基(-SO3H)如磺乙基和磺丙基、磷酸(-PO3H2)、羧基(-COOH)如羧甲基 (-OCH2COOH) 等。引入酸性基团的离子交剂可以解离出氢离子(H+)，在一定条件下，可以与其他阳离子(X+)进行交换，为阳离子交换剂。 R-A-H+ + X+ = R-A-X+ + H+,引入的活性基团，也可以是碱性基团，如伯胺(-NH2) 、仲胺(-NHCH3) 、叔胺 -N(CH3)2 、季胺-N+(CH3)3 等。引入碱性基团的离子交剂，在一定条件下，与氢氧根( -OH-)结合后，可以与其他