显微镜的结构使用及维护与植物制片技术1.ppt

1、显微镜的结构使用与维护及植物制片技术,Company Logo,基础知识,一、显微镜的结构使用及维护 显微镜的光学原理 显微镜的几个基本概念 显微镜的结构 显微镜的使用 显微镜的维护,基础知识,要知道的几个重要的分辨率:,人眼：0.2mm/250mm毫米 光学显微镜：0.2um微米 电子显微镜：0.2nm纳米,基础知识,显微镜的发展,1.1 人眼：人眼观察物体的能力是有限的。一般的情况下，在25cm的明视距离内，人眼只能分辨相距0.1-0.2mm的两个物体。也就是说，当两个物体相距不到0.1mm的时候，人眼就会把它们看成是一个物体了。这个极限便称为人眼的分辨本领。 1.2 放大镜：约在四百年前

2、眼镜片工匠们开始磨制放大镜。当时的放大镜的放大倍数只有35x,基础知识,1.3 显微镜的发展： 1590年，荷兰和意大利的眼镜制造者造出类似显微镜的放大仪器。 16731677年期间，列文胡克制成单组元放大镜式的高倍显微镜 19世纪70年代，德国人阿贝奠定了显微镜成像的古典理论基础。 1850年出现了偏光显微术； 1893年出现了干涉显微术； 1935年荷兰物理学家泽尔尼克创造了相衬显微术,基础知识,基础知识,列文虎克和他的显微镜（约1680）,基础知识,显微镜的使用,基础知识,显微镜概述 显微镜是观察细胞的主要工具。根据光源不同，可分为光学显微镜和电子显微镜两大类。前者以可见光（紫外线显微镜

3、以紫外光）为光源，后者则以电子束为光源。 1.光学显微镜 普通生物显微镜由3部分构成： 照明系统：包括光源和聚光器。 光学放大系统：由物镜和目镜组成， 是显微镜的主体。 机械装置：用于固定材料和观察方便， 包括镜台(载物台) 、调节器和物镜转换器(旋转器)等。,光学显微镜基本结构： 1. 照明灯(Lamp) 2. 聚光器(Condenser) 3. 载物台和切片夹(Mechanical stage and specimen retainer) 4. 推进器(Mechanical stage adjustment knob) 5. 物镜(Objectives) 6. 粗细螺旋(Course an

4、d fine focus knob) 7. 目镜(Oculars) 8. 照相机等接口(Connection to camera, etc.),基础知识,显微镜的几个基本概念： 1、光源：能发射光波的物体。 可见光频率范围：7.51014 - 3.91014 Hz。 真空中对应的波长范围：390nm 760nm 相应光色：紫、蓝、青、绿、黄、橙、红,基础知识,2、 数值孔径 数值孔径又叫镜口率。它是指所观察的物体与镜头间介质的折射率n与物镜镜口角一半的正弦值的乘积。用N.A或A.来表示。 即：N.A.nsin（/2）所谓镜口角是指被观察点射入物镜前 透镜的边缘光线之间的夹角。数值孔径是物镜与聚

5、光镜的重要参数， 一般希望它越大越好。一是增大镜口角，可以让标本与物体尽量靠近。但无论怎样靠近，总是小于180。这样，sin（/2）也小于。而空气的折射率n1。因此，干燥系物镜的数值孔径nsin（/2）总是小于1，一般在0.040.95之间。二是增大物镜与标本之间的折射率，可在物镜与标本之间加入折射率较大的介质。如香柏油的折射率n1.515，使用香柏油为介质时，可使数值孔径达到1.2以上。,物镜数值孔径,基础知识,3、分辨率 分辨率是指显微镜分辨被检物体细微结构的能力。它与分辨距离成反比。 分辨距离是指能被分辨开的两物点间的最小距离。分辨距离越小，显微镜的分辨率越高。 如果两物点间的距离小于分

6、辨距离，就会把两点误看成一点，无法看清其结构。 显微镜的分辨率是由物镜决定的。目镜只起放大作用，不能增加显微镜的分辨率。 在普通中心照明的情况下，物镜的分辨距离由下式决定。0.61*/N.A.式中：表示分辨距离, 单位是微米，表示照明光线的波长，单位也是微米。在可见光中，亮度最大而且对人眼最敏感的波长为0.55m，物镜最大的N. A.为1.4。代入上式可得近似为0.2m。即，使用普通光学显微镜，在中心照明的情况下，分辨距离的极限为0.2m。也就是说，小于0.2m的两物体，普通光学显微镜无法区分。,基础知识,4、 放大率显微镜的放大率等于物镜的放大率和目镜的放大率的乘积。从原理上讲，放大率可以做

7、的非常大。但是，如果标本的细节不能被物镜分辨开来，放大的再大，也毫无意义。理论上可以推导出来，显微镜最合适的放大率（称为有效放大率，用有效表示）是在物镜的数值孔径的5001000倍之间。即500N.A.有效1000N.A.在有效放大率范围内，眼睛可以长时间观察而不易疲劳。如果放大率低于500 N.A.，观察起来就很吃力。如果高于1000N.A.，则会使像质变坏，甚至造成不真实的像。因此，超过1000N.A.的放大率称为无效放大率。,基础知识,在物镜上，有镜口率(N.A.)的标志，它反应该镜头分辨力的大小，其数字越大，表示分辨率越高，各物镜的镜口率如下表： 物镜 镜口率(N.A.) 工作距离(m

8、m) 10 0.25 5.40 40 0.65 0.39 100 1.30 0.11 显微镜的总放大倍数等于目镜和物镜放大倍数的乘积， 公式为: M = K1xK2 。,基础知识,5、工作距离 工作距离是指显微镜调焦后，在使用标准盖玻片和标准机械筒长的情况下，物镜的下表面至盖玻片上表面之间的距离。物镜的放大率越高，工作距离越短。一般10倍以下的低倍物镜，工作距离为57mm，而100倍的油镜，其工作距离只有0.19mm左右。,基础知识,6、焦点深度 当显微镜调焦于标本中某一平面后，不仅这一物平面可以看清楚，而且和它相连的上下两个物平面也能同时看清楚。这上下两个物平面之间的距离叫做焦点深度，简称焦

9、深。 显微镜的焦深是很小的，而且数值孔径越大、总放大率越大，焦深越小。 例如，使用N.A.为1.25/100倍的油镜、12.5倍的目镜观察时，焦深只有0.27m。这就是说，调焦后一次只看清楚0.27m厚的一个薄层。而普通标本一般都有几个微米厚。要想看完整个标本，需要使用显微镜的微调机构，自上而下分层观察。,基础知识,焦点深度,7、视场 视场又叫视野。是指显微镜一次能够看到的被检物体的范围。 显微镜的视场由物镜的视场和目镜的视场共同决定的。普通物镜的视场小于20mm，大的可达40mm以上。普通10倍目镜的视场为14mm，大的可达24mm以上。物镜与目镜一旦设计好后，其视场便固定了。 视场的大小与

10、显微镜的总放大率成反比。总放大率越大，视场越小。解决的办法是利用移动器，使标本的各部分依次进入视场，轮流观察。,基础知识,8、镜像亮度 镜像亮度是指显微镜中所看到的物像的亮暗程度。 为了便于观察，我们希望所成的像亮一些。在外部光线不变的情况下，镜像亮度与数值孔径的平方成正比，而与总放大率的平方成反比。要想使镜像亮度大些，应使用大数值孔径的物镜，配以低放大率的目镜。 例如，在物镜相同的情况下，使用5倍的目镜与使用10倍的目镜相比，其镜像亮度要大4倍。 使用电光源的显微镜，其镜像亮度可以通过调节照明灯的亮度来控制。,基础知识,9、清晰度 显微镜成像的清晰度取决于其光学系统，尤其是物镜的光学性能。

11、影响清晰度的主要原因有以下5点： （1）所使用的盖玻片的厚度不合格 （2）调焦没有调到理想位置 （3）总放大率用得过大 （4）油镜的镜头没有擦干净 （5）镜片生霉等。,物镜 (objective) 物镜是光学显微镜成像系统中决定其分辨率或叫分辨本领的最关键部件。物镜是由若干个透镜组合而成的一个透镜组，组合使用的目的是为了克服单个透镜的成像缺陷，提高物镜的光学质量。 显微镜的放大作用主要取决于物镜，物镜质量的好坏直接影响显微镜映像质量，它是决定显微镜的分辨率和成像清晰程度的主要部件。,基础知识,物镜类型： (1) 按显微镜镜筒长度 (以mm计):透射光用160筒,0.17mm厚或更厚的盖玻片;反

12、射光用190镜筒,不带盖玻片;透射光与反射光用镜筒,筒长无限大 (2)按浸法特征:非浸式(干式)、浸式(油浸、水浸、甘油浸及其它浸法)。 (3) 按光学装置:透射式、反射式以及折反射式 (4)按数值孔径和放大倍数:低倍(NA0.2与10X),中倍(NA0.65与40X),高倍(NA0.65与40X)。 (5)按校正象差的情况不同,通常分为消色差物镜,半复消色差物镜,复消色差物镜,平视场消色差物镜,平视场复消色差物镜和单色物镜。,基础知识,物镜结构,目镜 目镜的作用是把物镜放大的实象再放大一级，并把物象映入观察者的眼中，实质上目镜就是一个放大镜。显微镜的分辨率能力是由物镜的数值孔径所决定的，而目

13、镜只是起放大作用。对于物镜不能分辨出的结构。目镜通常由若干个透镜组合而成，具有较大的视场和视角放大率,基础知识,聚光镜 用于照明物体并保证物镜具有一定数值孔径的会聚透镜。聚光镜装在载物台的下方。小型的显微镜往往无聚光镜，在使用数值孔径0.40以上的物镜时，则必须具有聚光镜。聚光镜不仅可以弥补光量的不足和适当改变从光源射来的光的性质，而且将光线聚焦于被检物体上，以得到最好的照明效果。,基础知识,聚光镜光栏 所谓光栏，从广义的角度可指一切限制入射光束截面的框孔都可认为光栏。 聚光镜光栏作用 （1）改变聚光镜的数值孔径以便与物镜的数值孔径相匹配，可调整图象的分辨率和反差。 （2）辅助调整亮度。,聚光

14、器数值孔径,孔径光栏开度与图象,显微镜的使用 观察前的准备工作 (1)观察者要养成显微镜镜检的工作习惯，观察时要双眼同时睁开，一边观察一边进行记录或描绘。 (2)观察时所用的材料、药品和各种器具要预先准备好。 (3)显微镜在使用之前应检查一下它的各个部件是否完整和正常，并对载物台、目镜、物镜以及聚光器上端透镜进行必要的清洁工作。,瞳 距 调 节,2. 显微镜的调节,屈 光 度 调 节,调节,粗细螺旋调节旋钮,基础知识,观察操作 低、高倍镜的使用: 先把低倍的物镜用粗调焦螺旋下降至离盖玻片0.5cm处，然后一边观察视野一边上升物镜，直至看到图像，再将标本移到视野中心，用细调焦螺旋把物镜调至最清晰

15、处，若要用高倍镜观察时，把所要进一步放大观察的部位移至视野中央，直接顺时针转换成高倍物镜，然后用细调焦螺旋调焦，至看清物像。,油镜的操作方法: 将高倍镜观察到的目标移动至视野中央 将高倍镜镜头挪开，于载玻片上滴一滴香柏油 将油镜镜头移动至视野中央，让油镜镜头浸入香柏油（至油晕不再扩大为止） 用微调焦螺旋调节至清晰 注意：油镜的操作需要较强的光线，故需将光线调至最强。 油镜用后处理： 第一遍：用擦镜纸拭去镜头上的镜油 第二遍：用擦镜纸蘸少许二甲苯（香柏油溶于二甲苯）擦去镜头上残留的油迹 第三遍：再用干净的擦镜纸擦去残留的二甲苯。,光线通过几种介质的折射率（n）比较：,倒置显微镜 倒置显微镜中最常

16、用的观察方法就是相差。由于这种方法不要求染色，是观察活细胞和微生物的理想方法。 这种方法提供带有自然背景色的、高对比度的、高清晰度的图像。倒置显微镜与正置显微镜的主要区别在于物镜 位于载物台下方，这样有利于观察时在上方对样品进行一些实时操作。,倒置显微镜操作过程基本与双筒的正置显微镜相似，需注意以下几点： 观察时可调节铰链式双目目镜至舒适的位置。 组织培养液或水溅到载物台上、物镜上或显微镜镜架上可能会损伤设备。如果溅上后，应该立即从墙上插座拔下电源线，擦去溅出液或水。 一定要轻柔转动光强调节钮，不要试图将旋钮转过终点位置。使用后一定要先将灯的强度调至最小再关电源。 使用后要旋转三孔转换器，使物

17、镜镜片置于载物台下侧，防止灰尘的沉降。,体视显微镜 它在观察物体时能产生正立的三维空间影像。立体感强，成像清晰和宽阔，又具有长工作距离，并可根据观察物的特点选用不同的反射和透射光照明，是适用范围非常广泛的常规显微镜。 由双筒目镜和物镜构成。放大率 780倍。在目镜内形成一个直立的放大实像，可以观察未经加工的物体的立体形状、颜色及表面微细结构,并 能进行显微解剖操作,也可以观察生 物机体的组织切片。,体视显微镜特点 1 双目镜筒中的左右两光束不是平行，而是具有一定的夹角体视角（一 般为12度-15度），因此成像具有三维立体感； 2 像是直立的，便于操作和解剖，这是由于在目镜下方的棱镜把像倒转过来

18、的缘故； 3 虽然放大率不如常规显微镜，但其工作距离很长 4 焦深大，便于观察被检物体的全层。 5 视场直径大。,体视显微镜的使用方法： 调焦：观察透明标本时，选用毛玻璃台板； 观察不透明标本时，选用黑白台板。然后松开调焦滑座上的紧固螺钉，调节镜体的高度，使其与所选用的物镜放大倍数大体一致的工作距离。调好后，须锁紧紧固螺钉。调焦时，建议选用平面物体，如印有字符的平整纸张、直尺、三角板等。 视度调节：调节目镜筒上的视度圈，直至标本的图像清晰为止。 瞳距调节：扳动两目镜筒，可以改变两目镜筒的出瞳距离。当使用者观察视场中的两个圆形视场完全重合时，说明瞳距已调节好。,基础知识,数码生物显微镜 数码显微

19、镜是在光学显微镜的基础上加了一个数码成像装置，可以将显微镜所成的像，在电脑屏幕上直接显示出来,motic数码显微镜的使用方法 1、准备 请将随机配件“A-B型USB线”的A端（矩形端口）插入计算机的USB端口，将B端（方型端口）插入显微镜的USB端口。 将随机配件“双插头主电源线”的一端插入100V-240V开关电源输入端，另一端与供电电源相接。 将12VDC开关电源输入端插入显微镜的12VDC电源输入端。 打开显微镜的电源开关，适当调整底座上的亮度调节手轮，此时底座内灯亮。,基础知识,2、光学部分的操作步骤 将所观察的标本放在载物台中央，使要观察的物体大致在载物台的通光孔中央，用切片压簧压紧

20、。 将各倍率物镜依次装于物镜转换器上，目镜插入目镜筒中。 操作时用低倍镜观察，通过聚光镜下的可变光栏来获得最佳的视野效果。 将镜筒下降使物镜靠近切片，然后眼睛观察目镜，旋转粗准焦螺旋使镜筒慢慢上升，在低倍镜下观察清楚后，把要放大观察的物象移至视野中央。 用转换器转到高倍物镜并用细准焦螺旋调整到清晰的物象，再调节光栏，以便获得最清晰的物象。,基础知识,3、 白平衡的操作步骤： 如果观察到的样本所显示的图象背景色及目镜视场背景色失真的情况下，就需要进行白平衡的操作： （1）、将兰色滤色片或其他种类的滤色片放入光道中，这时目镜视场的背景将会逐渐接近所期望的背景色。为达到最佳背景效果，请按住白平衡开关

21、1-2秒，调节背景色至你所希望的背景色后，即松开白平衡开关，这时白平衡的调节也就完成了。 （2）、如果需要改变已调好的图象背景，须将滤色片取出或通过调节显微镜上的调光旋钮来调节照明亮度，再上述步骤，即可重新调整图象背景。,4、数码部分的操作步骤： 1）、将Motic Lmages Plus 2.0ML 安装至电脑中，数码显微镜才可正常使用。 2）、将数码显微镜头部上的拉杆拉出至最后一档，此时显微镜处于既可目视观察又可进行CCD摄像状态。 3）、双击计算机桌面上的Motic images 图标，显微镜将自动进入预览状态。此时CCD罩上的指示灯亮，表明显微镜已经进入数码工作状态。在视窗中将显示被观

22、察切片的图象，该图象与从显微镜目镜观察到的一致。,5、显微镜测量软件Motic Images Plus2.0简介 实时静态图像捕捉； 可以JPG、BMP、TIF及SFC形式保存图像； 图像有1280 x1024，1024x768，800 x600，640 x480，320 x240 等像素大小； 计算机上全屏实时显示活体图像； 以AVI格式摄录运动影像。 先进的测量功能，包括周长、宽度、半径、圆周及角度的计算； 通过选择一个区域或图像，即时简便地进行测量； 数据可以导入电子数据表或数据库，以备分析。,荧光显微镜,荧光显微镜是以紫外线为光源， 用以照射被检物体， 使之发出荧光， 然后在显微镜下观

23、察物体的形状及其所在位置。细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光， 荧光显微镜就是对这类物质进 行定性和定量研究的工具之一 荧光显微镜用于研究细胞内物 质的吸收、运输、化学物质的 分布及定位等。,荧光显微镜和普通显微镜有以下区别：,2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；,3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除 紫外线，用以保护人眼。,1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上；,放大倍数,1、放大倍数目镜x物镜 2、显微镜放大的长度或宽度，

24、而不是面积。 3、放大倍数变大,视野中细胞数目变少 有两种情况： 10 x10 10 x40 细胞单行排列 细胞均匀分布,扩大4倍,8,2,除以扩大的倍数（4）,64,4,除以扩大的倍数的平方（42）,玻片的移动与物像的移动 由于是倒立的像，玻片的移动方向与物像的移动方向相反。,物像偏左下方,结论：物像偏什么方向，玻片向什么方向移动,视野中污点的判断 转动目镜，污点移动的则污点在目镜上，不动的不在目镜上。 移动玻片，污点移动的则污点在玻片上，不动的不在玻片上。 不在目镜、玻片上则在物镜上 物镜和玻片的距离与放大倍数的关系,放大倍数小 放大倍数大,日常维护保养 （）防潮 光学镜片就容易生霉、生雾

25、。 机械零件受潮后，容易生锈。 显微镜箱内应放置袋硅胶作干燥剂。 （）防尘 光学元件表面落入灰尘，不仅影响光线通过，而且经光学系统放大后，会生成很大的污斑，影响观察。灰尘、砂粒落入机械部分，还会增加磨损，引起运动受阻，危害同样很大。 注意保持显微镜的清洁。 （）防腐蚀 显微镜不能和具有腐蚀性的化学试剂放在一起。如硫酸、盐酸、强碱等。 （）防热 避免热胀冷缩引起镜片的开胶与脱落。 因此，生物显微镜要放置在干燥阴凉、无尘、无腐蚀的地方。使用后，要立即擦拭干净，用防尘透气罩罩好或放在箱子内。当显微镜闲置时，用塑料罩盖好，并储放在干燥的地方防尘防霉 。将物镜和目镜保存在干燥器之类的容器中，并防些干燥剂

26、。,机械系统的维护保养 滑动部位：定期涂些中性润滑脂 油漆和塑料表面的清洁：顽固的污迹可以使用软性的清洁剂来清洗，建议使用硅布。 塑料部分：用软布蘸水就可以清洗了。 注意：不要使用有机溶剂（如酒精，乙醚，稀释剂等）。因为会腐蚀机械和油漆，造成损坏。,光学系统的维护保养 透镜的清洁 使用后用干净柔软的绸布轻轻擦拭目镜和物镜镜片。聚光镜和反光镜只要擦干净就可以了。 有较顽固的污迹，可用长纤维脱脂棉或干净的细棉布蘸少些二甲笨或镜头清洗液（份酒精份乙醚）擦拭，然后用干净细软的绸布擦干或用吹风球吹干。 注意：清洗液千万不能渗入到物镜镜片内部，否则会损坏物镜镜片。纯酒精和二甲苯容易燃烧，在将电源开关打开或

27、关闭时要特别当心不要引燃这些液体。,定期检查 为了保持性能的稳定，建议做定期的检查，保养。 综上所述，对于生物显微镜的维护保养，主要做到防尘、防潮、防热、防腐蚀。用后及时清洗擦拭干净，并定期在有关部位加注中性润滑油脂。对于一些结构复杂，装配精密的零部件，如果没有一定的专业知识，一定的技能和专用工具，就不能擅自拆装，以免损坏零部件。,清洁工具,清洁工具,清洁液配方：1份无水乙醇3份乙醚,擦拭方法,注意事项: 塑料表面勿用乙醇乙醚混合液擦洗。 严禁用干擦镜纸擦拭镜头。 物镜严禁拆卸并防止振动。,二、园艺植物组织制片方法 植物制片是进行园艺植物科学研究所需用的一种基本方法，比如进行植物各个器官的解剖

28、构造观察、花芽分化研究、授粉受精观察、贮藏营养观测以及染色体观察等都需要进行制片。通过对切片结果的分析，可以比较不同试验处理的效果以及了解不同树种和品种相应的生物学特性等。,徒手制片 1、徒手制片（切片）及特点 徒手制片一般指徒手用刀片把新鲜的植物材料切成薄片的制片方法。用徒手切片的材料不宜过大，一般以表面不超过5-8mm 为宜。 主要优点是： （1）能及时观察研究植物生活组织结构和天然色彩；（2）方法及用具简单，不需切片机等机械设备，短时间即可完成。 主要缺点是 （1）对于微小、柔软、水分过多以及坚硬的材料，难以用徒手切成薄片； （2）对于操作不熟练者，往往切成厚薄不匀或不完整的切片。,2、

29、徒手制片的方法及注意事项 徒手制片最主要的工具就是刀片，常可用单面刀片。要获得良好的切片，首先要保持刀口的锋利。切片方法及步骤为： （1）准备工作（盛好清水的培养皿、显微镜、载玻片、盖玻片、刀片等用具）。 （2）拿取材料进行切片，材料可以是新鲜的材料，也可以是经过固定的材料（切片时，将欲切材料断面和刀片上滴上清水以保持材料湿润）。,（3）以左手拇指、食指、中指捏住材料，拇指应低于食指，以免切伤手指；材料高出指尖。 （4）右手执刀，将刀平放在食指上，刀口朝内，刀面与材料断面平行，然后以均匀快捷的动作自左前方向右后方以臂力带动刀片水平切割移动，不要用腕力。同时还要注意，切时动作要迅速，材料一次切下

30、，切忌停顿或拉锯式切割。,（5）连续切数片后，将切下的薄片轻轻移入盛水的培养皿中备用。然后挑选薄而透明的切片，放在载玻片上的水滴中，加上盖玻片制成临时制片进行观察。 在试验中，有时因各种情况所取材料无法马上进行制片。可以将其保存在固定液中，常用的固定液为F.A.A固定液，它不但是优良的固定液也是优良的保存液 。,夹持物 ：对于过于柔软或微小的材料（如叶片、细小的根尖等）需要借助一些夹持物 (如萝卜、胡萝卜、马铃薯块茎或通心草等)中进行切片。 使用夹持物时要先将夹持物切成35cm长、05 cm宽的立方形小块，将其中部纵切一缝、然后将修整好的材料夹入其中与支持物一起切片。,切取的标本,材料和夹持物

31、,滴水,放置标本,加盖盖玻片,叶的横切,。石蜡制片 石蜡切片是光学显微镜的制片技术中最常用的一种方法，属于永久制片。一般的植物材料都可以用此法制片。但有制作时间较长，操作过程复杂以及材料易发硬或发脆等缺点。,操作程序如下： 1. 材料的采集与分割：根据制片的目的和要求采集材料，材料要有代表性。材料采后应尽快进行分割固定。为使固定液能迅速的渗透材料，要进行材料分割。分割块宜小不宜大，一般不超过1cm3，分割后立即杀死固定。2. 杀死与固定：利用药剂迅速把细胞杀死，以保持材料本来的状态和结构。常用的固定液有F.A.A固定液、卡诺固定液等，前者还可作保存液。,常用的固定液 1.福尔马林-醋酸-酒精固

32、定液(FAA) 50%或70%酒精90ml + 冰醋酸5ml + 福尔马林(37%40%甲醛)5ml 是植物制片技术中较为良好的固定液和保存液。除单细胞和丝状藻类外，均可用此液固定 2. 福尔马林-丙酸-酒精固定液（FPA）福尔马林5ml + 丙酸5ml + 50%酒精90ml固定一般的植物组织，通常固定24h，可长久保存,3. 酒精-醋酸-氯仿固定液（卡诺固定液，Carnoy fixative）配方：纯酒精3份 + 冰醋酸1份配方：纯酒精6份 + 冰醋酸1份 + 氯仿3份适用于植物组织和细胞学材料，为研究细胞分裂和染色体的优良固定液。固定时间不宜过久。 4. 酒精-福尔马林固定液福尔马林26

33、（610）ml + 70%酒精100ml固定植物一般组织，尤其适用于萌发的花粉管的固定。通常固定24h，亦可长久保存,固定的注意事项 (1)固定的材料越新鲜越好。因此，采集或割取后须立即投入预先准备好的固定液中进行固定，切勿耽误。 (2)材料大小以不超过1cm3为宜，材料与固定液的比例为 1:20。 (3)根据材料的性质和制片的目的选择固定液。 (4)含有气泡的材料投入团定液后，材料不会下沉，故须将气泡抽出使材料下沉。最简易的抽气方法是将材料和固定液一并例入10ml的注射器中，抽动几次。也小用抽气装置进行抽气。 (5)固定时，要防止材料变形。 (6)外有被膜，而内部站构又极易松散的组织，应将整

34、个组织投入固定液22h后，再将其修成小块材料继续固定 (7)材料投入固定液后须经常摇晃。 (8) 容器外需贴标签。,3 、脱水 除去组织中的水分，便于透明、浸蜡、包埋等步骤的进行。常用的脱水剂为酒精。脱水采用等级脱水（系列脱水），即从较低浓度酒精开始，逐渐替换到高浓度酒精。 脱水的过程： 一般是30%乙醇50%乙醇70%乙醇80%90%100% 100% 脱水应逐步而不应跨越太大进行，否则将引起组织强烈的收缩或变形，在经无水乙醇处理时，应保证试剂的纯度。,4 、透明 将脱水剂从材料中除去，使材料透明，增加折光系数；便于下步的浸蜡和包埋等程序。透明剂是一种既能与脱水剂混合，又能与包埋剂混合的药剂

35、。常用的透明剂为二甲苯和氯仿，适用原则也是逐级进行，可减少材料收缩。 其过程为： 1/3二甲苯+2/3乙醇混合液1/2二甲苯+1/2乙醇混合液2/3二甲苯+1/3乙醇混合液二甲苯二甲苯 二甲苯是使用最广泛的一种透明剂，它具有渗透力强，溶解石蜡量大，又易挥发的优点，其缺点是易使组织收缩，变硬，变脆，因此透明时间应根据组织块大小及质地酌情而定。,5 、渗蜡 逐渐除去透明剂,并为包埋剂所代替。常用的包埋剂是石蜡。浸蜡过程是使石蜡慢慢溶于浸有材料的透明剂中，溶解在透明剂中的石蜡渐渐深入到材料的细胞中去，最后使透明剂完全被石蜡取代，以便切片。 50石蜡(50二甲苯) 40420.53h70石蜡 4850

36、 0.53h A杯纯蜡 5658 20minl hB杯纯蜡 565820minl h C杯纯蜡 565820min l h,6、 包埋 将浸蜡后的材料包埋在石蜡中。此步骤要迅速，且不要使石蜡块中有气泡。注意将样品编号封于蜡块上，以免样品混淆，以备切片。 包埋可用相同的器具，也可折叠一牛皮纸盒。 将液态石蜡缓缓倒入纸盒中，再用镊子轻轻将浸好蜡的组织块夹入纸盒，摆好位置，待石蜡冷却成固态即包埋完毕。,我们可以看到： 水和酒精可以相溶。 酒精和二甲苯相溶。 二甲苯和石蜡可以相溶。 因为以上相邻步骤所使用的液体均可以互溶，所以保证每一步骤液体能置换完全。 水和二甲苯不能相溶，乙醇和石蜡不能相溶，所以如

37、果有一个步骤的处理不彻底，残留的液体带到下一个步骤将不能互溶，最终带到渗蜡步骤中，成为细小的空洞，以至不能成为质地致密的石蜡块，也就切不成良好的切片。,7 、切片 修块： 切片前需修整蜡块，即将包埋好的一大块蜡块切开，使每一小块都含有一块组织，从切面看组织周围的石蜡相等。 固着：将修好的蜡块粘在大小适宜的样品台上，以便于固定在切片机上。 切片：一手持毛笔，一手转动切片机，切片的蜡片连成一长条蜡带。切下的蜡带放在一干净黑纸上。 贴片：将切下来的切片粘在洁净的载玻片上。粘片时先在载玻片上滴上一小滴粘片剂，加几滴蒸馏水，然后用镊子小心把切片放在水上，在35-40下，用拨针将切片伸直、展平，倾斜载片，

38、使水流去并烘干,8、染色 染料、染色液染料必须具备两个条件： (1)要具有颜色 (2)和被染物体之间具有亲和力。 根据用途分 (l)细胞核染色剂 用于细胞核的染色剂有天然染色剂的苏木精、洋红以及合成染色剂中的番红、结品紫、硫堇、甲苯胺蓝、甲基绿、美蓝、孔雀绿和焦油紫等。 (2)细胞质染色剂 用于细胞质的染色剂有合成染色剂中的曙红、亮绿、橘黄G、酸性品红、苦味酸和水溶性苯胺蓝等。 （3）脂质染色剂 用于显示脂质的染色剂有合成染色剂中的苏丹III、苏丹Iv、硫酸尼罗蓝及油红等。,操作方法： 脱蜡 1将两个装有二甲苯的染色缸，贴上脱蜡和透明； 2将待脱蜡的载玻片有蜡面的一面，朝向标签方向，载玻片小心插入脱蜡缸的齿槽中，待30min，当蜡片中材料的周围蜡熔去后，再转移至透明缸中510min，然后再转入染色等步骤。,染色方法： 二甲苯1/2二甲苯+1/2乙醇混合液100%乙醇95%乙醇85%乙醇70%乙醇50%乙醇30%乙醇1%番红水溶液112h水洗（去多余染液）35%酒精15min50%酒精15min70%酒精1-5min85%酒精15min0.1%固绿（溶于95%酒精）1040秒纯酒精（）30秒纯酒精（）30秒1/2纯酒精+1/2二甲苯5min二甲苯5min封藏,常用染色液的配制 番红水