植物次生代谢产物生产.ppt_第1页
植物次生代谢产物生产.ppt_第2页
植物次生代谢产物生产.ppt_第3页
植物次生代谢产物生产.ppt_第4页
植物次生代谢产物生产.ppt_第5页
已阅读5页,还剩33页未读 继续免费阅读

下载本文档

版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领

文档简介

1、提高植物细胞培养中次生代谢产物产量的方法,初生代谢(primary metabolism)是指能使营养物质转换成细胞结构物质、维持细胞正常的生命活动或能量的代谢,初生代谢的产物称为初生代谢产物(primary metabolites),如糖、蛋白质、脂类、核酸等。它们是维持细胞生命活动所必需的。 次生代谢产物(secondary metabolites)是指植物体内的一大类细胞生命活动或植物生长发育正常运行非必需的小分子有机化合物,其产生和分布通常具有种属、器官、组织和生长发育期的特异性,次生产物在植物中的合成与分解过程称为次生代谢(secondary metabolism) 。,前言,细胞培

2、养核心理论依据: 植物细胞的“全能性” ,即植物体任何一个细胞都携带着一套发育成完整植株的全部遗传信息,在离体培养情况下,这些信息可以表达,在一定条件下具有发育成一个完整植株的能力。,从细胞培养中得到的食物添加剂,从植物细胞培养获得药品,植物细胞大规模培养流程,Pathway events involved in biosynthesis of a metabolite in plant cells: primary metabolism and secondary metabolism (pre-biosynthetic, biosynthetic, and post-biosyntheti

3、c pathways).,1.外植体选择 2.高产细胞系选择 3.物理因素:光照、pH、通气、接种量 4.化学因素:培养基种类及激素 诱导剂 前提物质添加 抑制剂添加 5.培养方法:两步培养技术、两相培养、固定化 6.产物诱导释放,提高次生代谢物的产量的方法,1. 外植体选择,首先必须选择能够高效合成目的产物的植物种类。 起始培养材料还应考虑器官和组织特异性,通常选取自然状态下能够积累次生产物部位的细胞,这样的细胞经过培养以后常常具有合成目的产物的能力,或比较容易诱导合成目的产物。 东北红豆杉幼嫩茎、叶片以及芽三种外植体的愈伤组织中紫杉醇含量比较显示,以叶片为外植体的愈伤组织,其紫杉醇含量是其

4、它两种外植体形成的愈伤组织的3倍。 在茜草(Rubia cordifolia)愈伤组织培养中,来源于叶柄和茎的愈伤组织蒽醌的积累量比来源于茎尖和叶的愈伤组织高。,解决植物细胞培养生产次生代谢物含量低的最有效的手段之一是筛选高产细胞株。用来筛选的细胞来源可以是有足够生理和形态异质性的细胞群,也可以是通过物理或化学因子诱变处理产生的突变体群。 筛选方法:目测法,放射免疫法、酶联免疫法、流动细胞测定法、琼脂小块法等。,2. 高产细胞株的筛选,转基因技术 目前, 使用转基因技术中的稳定表达系统和瞬时表达系统, 生产出带有目的基因的高产细胞系, 然后进行大量筛选, 可 获得能生产特定次生代谢产物的目的细

5、胞系.,优势: 投资小, 成本低; 使用安全, 植物细胞的培养条件简单, 易于成活; 便于进行遗传操作; 经转化后的目的细胞系易于储藏, 方便生产。 主要方法: 土壤农杆菌介导转化法; 重组病毒感染植株; 基因枪转化法; 花粉管通道转化法。,反义技术,反义技术:利用现代分子生物学技术, 将人工合成的反义RNA 导入到植物基因组内, 与要抑制的代谢途径的关键酶基因RNA 结合形成双链RNA 来阻断基因的正常表达, 进而促进目的基因的表达。,原生质体融合,原生质体融合:指通过人为的方法,使遗传性状不同的两个细胞的原生质体进行融合,借以获得兼有双亲遗传性状的稳定重组子的过程。 意义:打破了微生物的种

6、界界限,可实现远缘菌株的基因重组。可使遗传物质传递更为完整、获得更多基因重组的机会。可与其他育种方法相结合,如把常规诱变和原生质体诱变所获得 的优良性状,组合到一个单株中。,发根培养,发根(hairy root):是整体植物或其某一器官、组织(包括愈伤组织)、单个细胞甚至原生质体受发根农杆菌感染所产生的一种病理现象,它起源于单个细胞,形成多分支、生长迅速的不定根。 优势:具有生长迅速且无需添加外源激素、拥有亲本植株的特征次生代谢途径和遗传稳定性、处于分化状态等特点,尤其是它的生长迅速和稳定性的特点是工业化生产梦寐以求的,也是细胞培养和一般器官培养所不能兼备的。,烟草发根,长春花发根,冠瘿组织是

7、植物受到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)侵染而诱导产生的,也具有激素自养、生长迅速等优点。用冠瘿组织培养不仅能生产原植物根中合成的有效成分,而且还能产生原植物地上 部分特别是叶中合成的成分,因此冠瘿组织作为一种新型的培养系统将具有更广阔的应用前景。,冠瘿组织培养,光照:对次生代谢产物的合成有重要影响. 不同植物细胞生产次生代谢产物时, 对光质和光量的要求是不同的, 如玫瑰茄悬浮细胞合成花青素时, 蓝光是促进玫瑰茄细胞产生花青素的最有效单色光, 产量为416 mg/ L, 和全色光差不多, 红光和橙光无效, 其他单色光随其波长接近蓝光, 正效应增强。 pH值:植物

8、细胞培养的最适宜pH 值在5-6 之间,但也存在差异。研究表明,南方红豆杉( Tax us chinensis ) 的愈伤组织生长及紫杉醇的含量受pH 值的影响较大,pH 5.5 对愈伤组织生最为有利,达接种量的3.84 倍,但紫杉醇的含量较 低,pH 7.0 时,愈伤组织的生长量仅为接种量2.80倍,而紫杉醇含量却达pH 5.5 时的2 倍多。,3. 物理因素,温度:不同种类的植物细胞培养对温度的要求是不同的, 最适的温度为25 左右, 超过30 , 对生长有明显的抑制作用. 较低的温度有利于生物碱的合成, 而高温则会导致次生代谢产物的合成基本停止。 通气状况:国外学者研究发现: 利用生物反

9、应器培养长春花细胞生产阿玛碱时, 溶解氧在29%-43% 时,溶解氧与阿玛碱的产量显著相关。 接种量:接种量影响次生代谢产物的有效积累, 接种时必须满足一定的接种量。,4. 化学因素,4.1 培养基成分 培养基的营养成分:一方面要满足植物细胞的生物量 增长,另一方面要使细胞能合成和积累次生产物。 一般来说,增加培养基的N、P和K的浓度能促进细胞生长,而适当增加糖浓度则有利于次生产物的合成。 生长调节剂的种类、浓度对细胞的生长、分化和次生 产物的合成起着重要的作用。 红豆杉细胞培养中,培养基中添加一定浓度的2,4-D,可以显著提高细胞生长速率,增加细胞生物量,添加适当浓度的BA和KT,则可提高紫

10、杉醇的积累。,4.2 添加诱导子,诱导子,是指能够诱导植物细胞中一个反应,并形成细胞特征性自身防御反应的分子。 目前使用的激发子可分为两类: 非生物诱导子(abiotic elicitor) 辐射、金属离子等。 生物诱导子(biotic elicitor) 生物激发子根据其来源不同又可分为外源性诱导子(exogenous elicitor)和内源性诱导子(endogenous elicitor)。外源性激发子多来源于微生物,包括经处理的有机体如菌丝,或微生物机体浸提物以及由微生物产生的多糖类、蛋白质类以及脂肪酸类等。内源激发子是来源于植物结构的化合物。如降解细胞壁的酶类、细胞壁碎片、寡聚糖以及

11、其它有机分子。,诱导子能增强细胞的呼吸作用, 提供产生次生代谢产物的 能量, 使细胞结构发生变化, 利于代谢物的形成、运输和积累。 目前应用最广、研究最多的是真菌诱导子, 如张长平等在红豆杉细胞悬浮培养体系中加入真菌诱导子, 结果发现, 紫杉醇的合成被加强, 产量得到了显著提高。 除真菌诱导子外, 目前在提高植物次生代谢产物方面研究得较多的还包括寡糖素、茉莉酸类、金属离子和紫外光等.金属离子作为诱导子主要有Cu2+ 、Ca2+ 、Mg2+等。 孙彬贤等以南方红豆杉悬浮细胞为材料, 在悬浮细胞中加入茉莉酸甲酯, 紫杉醇含量提高了10倍。,4.3 前体饲喂,前体指处于目标代谢物代谢途径中上游的物质

12、。上游化合物作为酶的底物,其浓度高低决定了催化反应速度的大小,浓度高则反应速度大。加入前体可以消除关键酶的阻碍或阻断内源性中间体的分隔和有效贮存,利于次生代谢物的生产。 向银杏培养基中添加异戊二烯等前体物质, 有效地提高了银杏内酯B 的产量. 向东北红豆杉悬浮细胞体系中加入前体物苯丙氨酸和醋酸钠,可显著提高紫杉醇含量且在实验范围内, 随前体物浓度的增加促进作用加强. 添加的前体物种类、浓度和时间对次生代谢产物的影响在很多细胞培养中也得到体现。,4.4 抑制剂的使用,植物次生代谢是多途径的, 是植物体内一系列酶促反应的结果, 在离体培养条件下有初生物质向次生物质的转化, 也有次生物质之间的相互转

13、化. 抑制剂可抑制支路代谢和其它相关次级代谢途径,使代谢过程有利于目的次生代谢物的产生。,5.1 两步培养 两步培养:生长与生产非耦联型的培养体系,细胞的最适生长条件和最适生产条件是不同的。两段培养法就是根据这点,把培养过程分为细胞生长期和次生代谢物生产期两个阶段。在不同阶段分别采取不同的培养条件,在细胞生长期使接种细胞大量繁殖,提高比生长速率,尽快获得高密度细胞;在生产期则可保持细胞的高密度,维持存活率,降低细胞死亡速率,持续获得目标产物。 优势:较好地解决了细胞生物量增长与次生代谢产物积累之间的矛盾,能同时满足细胞生长和产物合成的需要,大大提高了目的产物的产率。 以长春花细胞培养中激素为例

14、,在生长培养基中使用生长素类物质2,4-D可促进细胞的生长,在生产培养基中使用BA有利于产物生物碱的合成。,5 培养方法,技术产生背景:植物细胞次生产物在培养系统中的积累,有时对产物合成具有反馈抑制,有的产物分泌到培养基中后还会出现降解。要解决这些问题,最适宜的方法是边合成边回收,由此而产生的两相培养技术是较为理想的技术。 两相培养技术:是在培养体系中加入水溶性或脂溶性的有机物或者具有吸附作用的多聚化合物,使培养体系形成上、下两相,细胞在水相中生长,合成的次级代谢物质分泌出来后转移到有机相中。 优势:不仅减少了产物的反馈抑制作用,从而可以提高产物产量,而且可以通过有机相的不断回收及循环使用,实

15、现培养的连续化。两相培养技术能促进原来存储于细胞内部的产物分泌。,5.2 两相培养,两相培养技术主要由培养相和提取相组成,其技术关键是选择合适的提取相。一般来说,提取相的选择目标是具有较大的分离能力,同时对细胞细胞没有毒副作用,不影响产物的化学稳定性。 根据分离相的性质,两相培养可分为液液系统和液固系统。 液液培养系统中,分离相和培养基的化学性质和比重不同,在系统中形成明显区分的两相,其分离相主要使用液体石蜡、烷类化合物、甘油等。 液固系统是指提取相以固态形式存在于系统中,主要通过吸附分离目的产物,目前使用的主要有活性炭、硅酸镁载体、沸石、蚕丝以及树脂等。,Kim 等在摇瓶及鼓泡塔反应器中研究

16、紫草毛状根培养生产紫草素的两相培养, 以十六烷为吸附剂, 当加入量为30 mL/ L 时, 明显促进了紫草素的合成, 产量最高。,5.3 固定化细胞培养,技术背景:植物细胞个体较大、细胞壁僵硬且具有大的液泡,以上特性使其对剪切力十分敏感,易受机械损伤。 固定化细胞培养技术:是在可控条件下使植物悬浮培养的细胞聚集成团并且限制在特定空间和表面上,使这些细胞团在不损失生物量的同时能连续不断的分泌次生代谢物质。 优势:由于细胞位置固定,改善了生长微环境,培养过程中形成的物理及化学梯度利于细胞的分化及组织化,利于次生代谢物质的积累;细胞可反复利用,不需连续补加,利于非耦联生长的植物细胞次生代谢产物的合成

17、; 改善传质;生长和生产阶段可有效分开;减小培养体系中的剪切力;降低生产成本。,固定化的方法:主要有吸附在珠状、网状或泡沫表面的载体上,包埋在海藻酸钠、壳聚糖、琼脂糖等做成的多孔凝胶珠中,固定在平板或中空纤维膜上以及包埋在微胶囊中。 目前这一技术应用中遇到的难题是次生代谢产物释放的问题,因为大部分次生代谢产物都储存在液泡内,对其自身的积累起着负反馈作用,使固定化培养不能连续操作。现在,人工诱导植物细胞内次生代谢产物的释放又成为一个新的研究领域,但这些人工诱导手段往往使细胞丧失活性。另外,长时间的固定化培养也易使细胞受污染的机会大大增加。,固定化细胞培养,海藻酸盐包埋法装置,原理:海藻酸盐在Ca

18、2+等多价阳离子的存在下,糖中的羧基和阳离子之间形成离子键,从而形成胶体溶液。如果采用磷酸、柠檬酸、EDTA等离子复合剂处理,又能使胶体溶解释放出细胞。 操作:将水溶性的海藻酸钠配成水溶液,并把酶或细胞分散在其中,然后将其滴入凝固浴中(常用CaCl2 溶液),使海藻酸钠中的Na+,部分被Ca2+所取代而形成由多价离子交联的离子网络凝胶。,海藻酸盐包埋法,6. 产物诱导释放,培养细胞中有些产物可以分泌到培养基中, 但大部分产物一般都贮存于细胞液泡内。无疑增加产物外渗就有可能提高细胞内产物积累。 第一是增加细胞膜的通透性, 在培养基中加入各种诱导外渗物质如DMSO、活性碳、非离子吸附树脂或用超声波等处理都可有效地刺激产物外渗进而提高产物 产量。 第二是在培养基中加入吸收剂, 利用矿物油和miglyol 等形成的两相系统处理母菊属植物的培养细胞, 发现其渗到油相的精油含量比在单相系统中高70 倍。,有机溶剂处理:常用的有二甲亚砜及吐温-20等。 二甲亚砜是一种高度甲基化物质, 可用于改变细胞壁/ 膜的渗透性, 如二甲亚砜渗透处理能促进三七悬浮培养细胞, 使该细胞有效释放胞内皂甙. 刘

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

评论

0/150

提交评论