HPLC方法开发.ppt

1、系统方法开发,开发方法之前应明确以下各项 分离目的 样品性质和需要的预处理 检测方法 开发分离方法的步骤 选择合适的HPLC方法 开始建立方法 改善分离 检查问题 完善方法,有关样品组分和性质的重要信息,现有组分的数目 组分的结构以及具有的官能团 组分的分子量 组分的pKa 值 样品基质的性质：溶剂, 填充物等 要检测组分在样品中的浓度范围 样品溶解度,分离目的,是分析还是回收样品组分？ 是否以知样品所有成分的化学特性，即是否需要定性分析？ 是否需要解析出样品的所有成分 (例如, 对映异构体, 非对映异构体, 同系物, 低聚物, 痕量杂物)? 如需定量分析，需要多高的精密度？,分离目的,本法需

2、用于几种样品剂型(如原料,制剂, 环保样品等) ？ 未来使用该方法分析的样品数的多少？ 未来使用该方法的实验室拥有的HPLC设备 和技术能力？,样品的性质以及是否要进行预处理,来自不同形态的样品: 可以直接进样的溶液 需要稀释，缓冲，或者加入第二种溶剂的溶液 能溶解在流动相中的固体物 配制样品前应称重 含有能引起柱效损失的物质的样品- 要求萃取或过滤 被分析物中含有不溶物- 要求萃取或过滤,检测方式,根据不同的分离目的需要不同的检测器. 测量单个或少量的化合物时, 理想的检测器应该仅仅对目标物有响应而对其他物质没有响应 高选择性和高灵敏度 对于定性分析和制备色谱, 理想的检测器是通用型的检测器

3、, 这样混合物中的每一种物质都能被检测出来. 并且不需要特别高的灵敏度,检测器,检测器化合物类型 UV/PDA最常用的检测器 不适用于烷烃和糖类 RID 通用型检测器 荧光检测器 适用于能产生荧光的物质 具有高选择性和灵敏度 电化学检测器适用于易氧化和降解的化合物 具有高灵敏度和选择性 电导检测器适用于可电离的化合物，如有机酸和无机酸 柱前或柱后衍生化,选择一种 HPLC模式,对于大多数的样品，开发方法经常是从反相模式开始的. 离子对反相模式和 正相模式 是第二选择. 具有以下任何性质的样品经常要求一些特殊的条件. 大分子量的样品, 如聚合物, 碳水化合物或蛋白质 含有光学异构体的混合物 (对

4、映体) 含有其他异构体的混合物 含有无机盐的样品,影响 HPLC 分离的反相条件,不同分离条件 优先选择 柱 尺寸(长度, I.d.) 15 , 25 cmL x 2 - 6 mmID, 粒径 3-5 um 固定相 C-8 or C-18 流动相 溶剂A/B Water/ACN %-B 不定的 缓冲液 (化合物, pH, 浓度) 10-100 mM磷酸盐, pH 2-7 添加剂 (eg., 离子对试剂, 氨) 阳离子中加 1-20 mM 高氯酸钠阴离子中加1-20mMTBA(四丁基铵） 流速 0.1-2 ml/min 温度 10-60 oC 样品 体积 100 ul 质量 100 ug,主要H

5、PLC 方法的特性,离子交换模式 流动相：水相，另以缓冲液控制pH 值 色谱柱: 阳离子或阴离子交换柱 尺寸排阻色谱 流动相：水 相(凝胶过滤) 有机相 (凝胶渗透) 色谱柱: 二醇基（凝胶过滤用） 聚苯乙烯或硅胶（凝胶渗 透用）,分离无机离子 混合物的首选(离子色谱法)，分离核酸和蛋白质以及有关的化合物的良好的选择 . 分离高分子量样品，如蛋白质和聚合物的良好首选，也可用作测量G分子量的分布,次要 HPLC 方法的特性,方法/特点/色谱柱,何时应用此方法,改善分离,两个相邻的峰达到基线分离，其分离度Rs1.5. 对简单混合物，应使分离度Rs2 对含10个或更多成分的样品, 分离度的要求可降到

6、Rs1,开发HPLC方法的分离目的,目的 内容 分离度 精密和抗干扰的定量分析要求 Rs 1.5 分离时间 小于5-10 min时，日常工作较理想 定量 含量测定：RSD1%; 要求不高或痕量分 析, RSD5% 压力 最好150 kgf/cm2， 200 kgf/cm2 通常情况（假设是新柱） 峰形 最好是信噪比大的窄峰 溶剂消耗 每个样流动相的消耗量越小越好,检查问题,在方法开发期间，应重视方法引起的问题 柱效下降 谱带增宽 样品的溶剂不适合 高压引起的柱效下降 高压 样品前处理不当 流动相或其PH值不适合,完善方法,方法本身在日常工作中应经受住考验，应适用于所有的有关实验室 HPLC 方

7、法必须严格适合下列标准 精确度 准确度 稳定性 可转移性 方法有效性检查对方法开发来说是非常重要的,开发 HPLC方法的步骤,1.有关样品的信息, 明确分离目的 2. 是否需要特殊的 HPLC步骤、 样品预处理等. 3. 选择检测器和检测器设备 4. 选择LC 方法，进行预实验; 评估分离条件 5. 最佳分离条件 6. 对特殊程序的问题和要求进行检查 7. 对方法进行常规实验室有效性检查,检测器,紫外可见光检测器 (UV/VIS) 光电二极管阵列检测器 (PDA) 荧光检测器 (RF) 电导检测器 (CDD) 示差折光检测器 (RID) 电化学检测器 (ECD) 质谱检测器 (MS) 蒸发光散

8、射检测器 （ELSD）,紫外/可见光检测器,Ein,Eout,A= eCl = - log (Eout / Ein),l,C : 浓度,朗伯比尔定律,(A : 吸收),池,紫外/可见光检测器,样品池,参比池,光电二极管,光电二极管,Ein,Ein,Ein,光栅,D2 / W 灯,l,Eout,朗伯-比尔定律,A= eCl = - log (Eout / Ein),吸收,浓度,线性范围,2.5,光谱图,275 nm,208 nm,275 nm,208 nm,样品池,512 光电二极管阵列检测器,光栅,D2 / W 灯,二极管阵列检测器,一个元件检测一个 波长下的所有吸收,二极管阵列检测器,时间,

9、长波,吸收,色谱图,光谱图,二极管阵列检测器,可以用光谱图对未知峰进行定性. 可以进行峰 纯度的检测,检验分离参数时可使用光谱图,2,3,1,1: 壬二酸,2: 安息香酸,3: 硝基安息香酸,30%,15%,乙腈浓度,min,光谱鉴定,洗提顺序,Peak 1,Peak 2,Peak 3,乙腈,30%,15%,Azelaic acid,Benzoic acid,Nitrobenzoic acid,光谱3点比较法,乙酰水杨酸,down slope,up slope, 峰顶点,荧光检测器,+ hn1,hn2+,*,A,A*,A,hn1,hn2,激发波长,Emission Wavelength,荧光,

10、*,荧光检测池的设计,衍生化试剂,OPA 伯胺衍生化试剂,CHO,CHO,o-phthalaldhyde (OPA),+ R-NH2,N-R,A,A,ADAM 脂肪酸衍生化试剂,CHN2,9-anthryldiazomethane (ADAM),+ R-COOH,CH2OCOR,示差折光检测器,光学系统,示差折光检测器,糖的色谱图,分析条件 柱 : Shim-pack CLC-NH2 流动相 : Acetonitrile / water = 7 / 3 流速 : 1.0 mL/min 温度 : 室温 Peaks 1. 甘油l 2. 木糖醇 3. 果糖 4. 葡萄糖 5. 蔗糖 6. 乳糖 7.

11、 乳糖,电导检测器,I,V,L,A,A,K (电导率) = I A / E V =A cm2 / L cm x k (k : 特殊电导率) k= (I/E)x(L/A),电极,电导检测器,温度对电导率有很大的影响. 必须将检测池置于恒温装置中.,分析条件 柱 : Shim-pack IC-A3 流动相 : 8.0 mM p-hydroxybenzoic acid 3.2 mM Bis-Tris * 流速 : 1.5 mL/min 温度 : 40 C 进样量 : 100 uL Peaks 1. F (1.4 ppm) 2. Cl (10200 ppm) 3. NO2 (10 ppm) 4. Br

12、 (43 ppm) 5. NO3 (44 ppm) 6. SO4 (431 ppm),尿液中阴离子的色谱图,Bis-Tris : bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane,电化学检测器,工作电极,辅助电极,参比电极,ECD检测器的原理, 应用 GC: 苯酚类化合物 一般使用 Pt: H2O2 Ag: 卤素离子 Au: 糖分析,儿茶酚胺类物质的色谱图,分析条件 柱 : Shim-pack CLC-ODS 流动相 : 80 mM phosphate buffer (pH=2.7) 100 mM NaNO3, 200 mg/l SO

13、S 5 mg/l EDTA, 4 % acetonitrile 流速 : 1.0 mL/min 使用电压 : + 0.8 V 温度 : 40 C 进样量 : 10 uL Peaks 1.去甲肾腺上素 ( 5 ppb) 2. 肾腺上素 (5 ppb) 3. 多巴胺 (5 ppb),LCMS大气压离子化,电喷雾(ESI) 大气压下化学电离(APCI),H,i,g,h,V,o,l,t,a,g,e,3,),C,o,u,l,o,n,E,x,c,l,u,s,i,o,n,I,o,n,E,v,a,p,o,r,a,t,i,o,n,2,),E,v,a,p,or,a,t,i,o,n,o,f,S,o,l,v,e,n,

14、t,i,q,u,i,S,a,m,p,l,e,s,L,i,q,u,i,d,S,a,m,p,l,e,s,H,e,a,t,e,r,C,o,r,o,n,a,D,i,s,c,h,a,r,g,e,N,e,e,d,l,e,Ion molecular reaction,Nebulizing gas,Nebulizing gas,LCMS的设计,可以分析哪种类型的化合物 ?,ESI 药物及其代谢物 农药 蛋白质 多种天然产品 (-OH, -NH2,-COOH, SO2, PO3 etc.) APCI 农药 类固醇 药物,农药的分析,农药的分析 (质谱图),不同检测器的比较,LOD : 检测限 (S/N=3) G

15、C : 梯度兼容性 PDA 的灵敏度稍低于紫外检测器的灵敏度,UV/ VIS,RF,RID,CDD,ECD,MS,LOD,1 ppb,10 ppt,100 ppb,1 ppb,10 ppt,1 ppb,GC,Yes,Yes,No,No,No,Yes,HPLC反相柱,C18 (ODS) type C8 (octyl) type C4 (butyl) type Phenyl type TMS type Cyano type,-Si-C18H37,Si,非极性,相互作用力是什么?,OH,OH,C18 (ODS),强,弱,疏水性 相互作用,疏水性,如果样品有 CH3CH2CH2- : 碳链 : 芳香基

16、 如果样品有 -COOH : 羧基 -NH2 : 氨基 -OH : 羟基,疏水力变强,疏水力变弱,反相模式下流动相溶剂的选择,水 (缓冲液) + 有机溶剂 在有缓冲液的情况下, 缓冲液的浓度和PH是非常重要的 甲醇，乙腈和 THF 是常用的有机溶剂 优化水（缓冲液）和有机溶剂的比例是非常重要的,溶剂极性降低对分离的影响,20 % 30 % 40% / H2O,1 : p-Hydoxymethylbenzoate 2 : p-Hydoxyethylbenzoate 3 : p-Hydoxypropylbenzoate 4 : p-Hydoxybutylbenzoate,有机流动相: MeOH,固

17、定相的影响,C18 (ODS),强,C8,样品,样品,样品,C4,媒介,弱,固定相的影响,分析条件 柱 : Shim-pack CLC-ODS 流动相 : MeOH : H2O = 7 :3 流速 : 1.0 mL/min 温度 : 40 C 进样体积 : 10 uL 检测器 : UV-254 nm 峰 1. 苯甲酸甲脂 2. 苯甲酸乙脂 3. n-丙基 苯甲酸 4. n- 丁基 苯甲酸,ODS C8 TMS,反相离子对色谱法,离子对试剂,离子对试剂,阴离子化合物 氢氧化四丁基铵(TBA) 阳离子化合物 四烷基磺酸钠 (C4) 五烷基磺酸钠 (C5) 六烷基磺酸钠 (C6) 七烷基磺酸钠 (C

18、7) 八烷基磺酸钠 (C8) 十烷基磺酸钠 (C10),离子对色谱分离羧酸,离子对色谱分离含氨基的化合物,分析条件 柱 : Shim-pack CLC-ODS 流动相 : A : B = 9 : 1 A 100 mM 磷酸缓冲液 (pH=2.1) 0.8 mM 辛烷磺酸钠 B 乙腈 流速 : 1.5 mL/min 温度 : 40 C 进样体积 : 10 uL,Peaks 1. Nicotinic acid6. Thiamine 2. Nicotinamide7. Caffeine 3. Pantothenate 8. Folic acid 4. Pyridoxine 9. Biotin 5.

19、Riboflavin 10. Riboflavin Phosphate,离子对 重点考虑,离子对试剂的类型 离子对试剂的浓度 溶剂的 pH,离子对试剂的类型,己烷磺酸盐 戊烷磺酸盐,离子对试剂的浓度,HPLC 的正相柱,硅胶基底 : 常用 氰基 : 常用 氨基 : 分析糖 二醇基柱: 分析蛋白质,硅胶,Si,Si,-Si-CH2CH2CH2CN -Si-CH2CH2CH2NH2 -Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH),修饰后的Si,相互作用力是什么?,OH,HO,SiOH,SiOH,强,弱,or,非常弱,氢键,氢键力,如果样品有 -COOH : 羧基 -NH2 : 氨基 -O

20、H : 羟基 氢键力变强. 如果样品没有任何官能团，象碳水化合物 如果样品有大的基团, 由于空间障碍 氢键力变弱.,正相模式下流动相的选择,主要试剂 烷烃 (戊烷, 己烷, 庚烷, 辛烷) 芳香烃 (苯, 甲苯, 二甲苯) 亚甲基氯化物 氯仿 四氯化碳 辅助溶剂 甲基-t-丁基 醚 (MTBE), 二乙醚, 四氢呋喃 (THF), 二氧杂环乙烷, 嘧啶, 乙酸乙酯, 乙腈, 丙酮, 乙醇 (2-propaol, 乙醇, 甲醇) 为了调整保留时间，可以选择一种主要试剂然后再加入辅助试剂。没有紫外吸收的溶剂更容易被检测出来。,增加溶剂极性,0 % 2 % 5% / MeOH,1 : Dioctyl

21、 phthalate 2 : Dibutyl phthalate 3 : Diethyl phthalate 4 : Dimethyl phthalate,溶剂 : 己烷,反相 保留时间重复性好 固定相耐用 正相 对立体异构体有很好的分离 (Vitamin E 等.) 保留时间有变化,反相模式与正相模式的对比,离子交换模式,N+,R,R,R,样品,SO3-,样品,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,+,离子吸引力,离子交换模式,生物领域 (蛋白质, 农药, 氨基酸分析) 离子色谱 阳离子交换剂 强阳离子交换剂(SCX)(R-SO3-) 弱阳离子交换剂(WCX) (R-COO-) 阴

22、离子交换剂 强阴离子交换剂 (SAX) (R4N+) 弱阴离子交换剂 (WAX)(DEAE),用WCX柱进行蛋白质分析,分析条件 柱 : Shim-pack WCX-1 流动相 : A 20 mM phosphate buffer (pH=6.0) B A+0.25M sodium sulfate A - B 30 min linear gradient 流速 : 1.0 mL/min 温度 : 室温 检测器 : UV-280 nm 进样量 : 10 uL 峰 1.白蛋白 2.肌球素 3. a-糜蛋白酶原 A 4. liponuclease A 5. lisozyme,尺寸排阻色谱 (SEC)

23、,GPC (凝胶渗透色谱) 主要用于聚合物科学领域 GFC (凝胶过滤色谱) 主要用于生命科学领域,SEC原理,无相互作用力 流出时间不同,流出顺序,GPC / GFC的目的,GPC 聚合物分子量测量 GFC 蛋白质分离,MW和 RT的关系,校正曲线,依次进入标准聚合物来确认 分子量和保留时间的关系.,实际样品注射,计算 MW, 要求GPC 软件.,使用GFC 柱进行蛋白质的分离,分离条件 柱: Asahipak GFA-50 流动相 : 0.1 M sodium phosphate 0.1 M NaCl (pH=7.0) 流速 : 0.5 mL/min 温度 : 室温 检测器 : UV-28

24、0 nm 进样体积 : 10 uL 峰 1. glutamate dehydrogenase 2. lactate dehydrogenase 3. enolase 4. adenylate kinase 5. cytochrome C,使用反相模式对分离进行优化,HPLC方法的开发,分离效果的改善,相邻两峰完全分离其分离度 Rs1.5.,完全分离时的分离度,Rs = 1.0,Rs = 1.50,峰形不是三角形 而是高斯分布.,峰面积重叠率,峰重叠百分率是分离度和峰面积比的函数,(*) 小峰仅仅以肩峰出现,分离度, Rs,N : N1和N2的平均值 k : k1和k2的平均值,是 选择性 柱效

25、 容量因子的函数,容量因子, k,t1 = 溶剂峰的保留时间 t0 = 溶剂峰的柱死时间 (非保留时间),理论塔板数, N,方程 : N = 16 x ( Rt / W )2 实际修饰方程 : N = 5.54 x ( Rt / W 1/2 )2 综合修饰方程 : N = 6.28 x (Rt x H / Area)2,分离因子 a,分离因子是两个峰分离度的一个体现,选择因子对分离度的贡献,柱效对分离度的贡献,容量因子对分离度的贡献,影响分离度的因素,怎样提高 N- 第一步 -,HETP = 柱长 / N,每个柱子都有最佳流速,HETP (或N) 和 流速,要获得好的柱效 , 4.0 mmID

26、 0.6 mL/min 4.6 mmID 0.8 mL/min 6.0 mmID 1.0 mL/min 以上设置是最佳的.,增加柱子数目,虽然增加柱子数量能提高N, 但是分离度仅仅能增加40. 同时柱压会剧烈增加.,增加柱子数量并不实用,4.0 mmID 0.6 mL/min 4.6 mmID 0.8 mL/min 6.0 mmID 1.0 mL/min,N,Flow rate,3 mm,10 mm,5 mm,降低填料粒径并且选择每根柱子的最佳流速. 如果改变了粒径, 必须使用相同的填充物. 否则会改变选择性,怎样提高 N- 第二步 -,降低有机溶剂的比例. 尽量使k= 1 10， 最好使k=

27、 2 10， k值小于2，分离度不够 k值大于10，会扩展运行时间 峰加宽 (1) 灵敏度变小 (2) 定量准确性变差,怎样改善 k,甲醇 / 乙腈/ THF 1) 与水易于混和 2) UV 可以透过 3) 低粘度 4) 极性有差异 与甲醇相比，乙腈有以下优点 1) 操作压力更低 2) 洗脱能力稍高 3) 在低波长范围内可以应用 (185-205nm) 选择乙腈更好. 然而, 由于价格因素和ANC的毒性，甲醇仍然是首选,溶剂的选择,溶剂最优化,甲醇/水混合物做流动相 样品组成: 硝基苯, 苯, 2,6-二硝基甲苯 2-硝基甲苯, 4-硝基甲苯, 3-硝基甲苯,甲苯, 2-硝基-1,3-二甲苯

28、4-硝基-1,3-二甲苯, m-二甲苯,溶剂最优化,ODS 柱 样品组分 Peak 1: nitorbenzene Peak 2: benzene Peak 3: 2,6-dinitrotoluene Peak 4: 2-nitrotoluene Peak 5: 4-nitrotoluene Peak 6: 3-nitrotoluene Peak 7: toluene Peak 8: 2-nitro-1,3-xylene Peak 9: 4-nitro-1,3-xylene Peak 10: m-xylene,k和有机溶剂百分率(B%)间的关系,log(k) = a(B%) + b (a, b

29、 系数),对于小分子, a 有机溶剂每增加 10% (B%) ，每个波段的k d大约降低 3.,分离度图,如果可以事前预测保留时间, 就可以计算出分离度(Rs). 通过左边的有机溶剂浓度与分离度之间的关系示意图，可以对有机溶剂的浓度进行最优化,怎样改善 a,改变 有机溶剂类型 pH 缓冲液浓度 柱温 柱类型（C8, 氰基和苯基） 柱基质 流动相中加入其他有机溶剂,a 和溶剂类型之间的关系,由于选择性(a)不能被准确预测, 因此选择合适的溶剂组成是比较浪费时间的, 溶剂极性和溶剂类型的关系 ,改变溶剂类型,虽然使用某一种有机溶剂不能得到好的分离度, 但只要它们之间的关键峰对不一样，几种有机溶剂的

30、组合却可能有好的分离度, MeOH/H2O 注意 : c,d THF/H2O 注意 : a,b, MeOH/THF/H2O ,离子强度和pH,对于含有酸性和碱性化合物的样品, 保留时间随着离子强度和 pH的变化而变化 为了获得好的重现性，选择合适PH值的缓冲液浓度是非常重要的 选择合适的缓冲液,R-COO- 和 R-NH3+,k和pH之间的关系,在反相色谱中， k 和 pH之间的关系不是线性的或者是二次方程的，流动相的PH值对 有机酸和胺的 k 值有影响.,只有在pKa+/- 1.5范围内, 才会显示k 和pH 的线性关系,R-COOH RCOO- + H+ (pKa=4.5) R-NH3+

31、R-NH2 + H+ (pKa=6.0),流动相pH值对化合物分离的影响,1:苯甲酸 2:山梨酸 3:对羟基苯甲酸甲酯 分析条件 1mL/min ODS 柱 10mM 磷酸盐缓冲液 75% 乙腈 25% 40oC UV-240 nm,样品pKa值是分子结构的函数,调整 pH值的注意点,当流动相的pH值与目标样品的pKa值 非常接近时, 应该仔细调整pH 值, 因为流动相的pH 值对k有影响. 一般, 应该选择对k没有影响的pH.,k和缓冲液离子强度的关系,log(k) 和 流动相缓冲离子强度之间的关系如下 log(k) = a(mM) 2 + b(mM) + g 一般不使用浓度高于 100 m

32、M的缓冲液.因为高浓度的缓冲液会对LC的硬件造成麻烦，如降低柱塞杆密封圈的寿命、堵塞管路造成压力升高等. 10 - 20 mM (pH 3 - 4) 的缓冲液是最常用的,离子强度对PTH 衍生物的保留特性的影响,H: 组氨酸 R: 精氨酸 苯基柱 梯度 15min内,甲醇5.3%-13.2%, THF 9.1%-25.8%, 磷酸盐缓冲液(pH3.2) 85.6%-61%，保持最终浓度 15min (a) 12 mM 缓冲盐 (b) 8 mM 缓冲盐 (c) 4mM 缓冲盐,缓冲液 pH值和pKa值之间的关系,log(K) = log ( A- H+ / AH ) = log ( A- / A

33、H ) + log ( H+) pH = pKa + log ( A- / AH ),K = A- H+ / AH ,有机酸缓冲液的pKa值,磷酸盐缓冲液 醋酸盐缓冲液 柠檬酸盐缓冲液,(conc. unit : mM ),pH 缓冲作用范围 pKa +/- 1.0,pH值校正,10 mM pH=7.01 磷酸盐缓冲液 pH=7.01 的10 mM磷酸缓冲液 正好等于10 mM磷酸缓冲液的 pKa2值. 在这种情况下 A- 和 AH 的浓度是相同的. A- 指 Na2HPO4 ，AH 指 NaH2PO4. Na2HPO4 = 5.0 mmol, NaH2PO4 = 5.0 mmol per 1

34、 L 10 mM pH=6.01 磷酸盐缓冲液 pH = pKa + log ( A- / AH ) 6.01 = 7.01 + log(Na2HPO4 / NaH2PO4) -1 = log(Na2HPO4 / NaH2PO4) 0.1 = Na2HPO4 / NaH2PO4 Na2HPO4 + NaH2PO4 = 10 mmol 每 1 L Na2HPO4 = 9.09 mmol, NaH2PO4 = 0.91 mmol per 1 L,pH 值校正(2),如果仅仅用H3PO4 和 Na3PO4 来制备磷酸盐缓冲液. 10 mM pH=6.01 磷酸盐缓冲液 Na2HPO4 = 9.09

35、mmol, NaH2PO4 = 0.91 mmol 每 1 L 由上面的浓度计算对离子 Na+的浓度. Na2HPO4 有两个 Na +, 因此9.09 x 2 = 18.18 mmol NaH2PO4 有一个 Na +, 因此 0.91 x 1 = 0.91 mmol 全部 Na + 浓度 = 18.18 + 0.91 = 19.09 mmol Na+ 仅仅由 Na3PO4提供并且Na3PO4 有三个 Na +, Na3PO4 浓度为 19.09 / 3 = 6.36 mmol. 全部 PO4 3- 浓度 由H3PO4 和 Na3PO4提供, 因为 Na3PO4 浓度是 6.36 mmol,

36、 H3PO4 浓度为 10 6.36 = 3.64 mmol. 最后, H3PO4 是 3.64 mmol ， Na3PO4 is 6.36 mmol每 1 L.,pH值校正(3),如果仅仅用H3PO4 和 NaOH 来制备磷酸盐缓冲液. 10 mM pH=6.01 磷酸盐缓冲液 Na2HPO4 = 9.09 mmol, NaH2PO4 = 0.91 mmol 每 1 L 由上面的浓度计算对离子 Na+的浓度. Na2HPO4 有两个 Na +, 因此 9.09 x 2 = 18.18 mmol NaH2PO4 有一个 Na +, 因此 0.91 x 1 = 0.91 mmol 全部 Na 浓

37、度 = 18.18 + 0.91 = 19.09 mmol Na+ 仅仅由 NaOH 提供, 因此 NaOH 浓度必须是19.09 mol. PO4 3- 仅仅由 H3PO4 提供, 因此 H3PO4 浓度必须是 10 mmol. 最后, H3PO4 是 10 mmol每1L ， NaOH 是19.09 mmol 每 1 L.,怎样调整缓冲液的pH值,如果配置低浓度缓冲液，可使用pH 计算 使用PH计配置缓冲溶液时，第一次必须记录使用化合物的体积或重量. 第二次制备缓冲液，所用的化合物的体积或者质量可使用标准记录，而不需PH计. pH 计用于测定 pH.,k 和柱温之间的关系,log(k) 和

38、柱温之间的关系如下. log(k) = a/T + b 通常温度每改变一度， (k) 改变1%-2%. 当不使用温度改变保留值和灵敏度时，也应该控制温度以保持重现性. 虽然温度高时柱压低, 但是会降低柱子寿命. 一般使用温度为20 - 60 oC.,温度对化合物分离度的影响,1:benzoic acid 2:sorbic acid 3:methylparaben 分析条件 1mL/min ODS 柱 10mM 磷酸盐缓冲液 (pH2.6) 75% 乙腈 25% UV-240 nm,温度的影响,如果升高温度, 1) 样品的保留时间变短 2) 流动相的粘度降低 3) 柱压降低 4) 理论塔板数升高

39、 以下情况时应改变柱温 1) 两个化合物的分子量显著不同时 2) 组分洗脱慢时 3) 使用离子交换色谱和离子对色谱时,更换为其他类型的柱子,将柱填充物由C-18(ODS)改变为 苯基或氰基对灵敏度(a)可能有影响.,柱子极性对 20 PTH-amino acids的分离度的影响,填充物对分离效果的影响,ODS column Phenyl column,1:benzoic acid 2:sorbic acid 3:methylparaben 分析条件 1mL/min 40oC 10mM 磷酸盐 (pH2.6) 75% 乙腈 25% UV-240 nm,改为其他类型的填充物,不同的柱填充物的性质也

40、不同， 象 吸附力 极性 硅胶特性 1)球形或无定型 2) 粒子大小 3) 微孔或无孔 4) 孔径 5) 表面积 6)碳含量 7)残留硅烷醇 8)残余的重金属,硅胶特性球形和无定型,无定型 球形,制备用 分析用,硅胶性质粒径,粒径 5 um,5 um 的粒子是最常用的. 然而, 这是指平均粒径为 5 um，也存在 3um 和d 10 um 的粒子. 对于好的柱子，窄范围的粒径分布是重要的.,硅胶性质有孔和无孔,粒径 : 80-120 A,正常的硅胶表面有微孔. 分析用的柱子, 微孔大小为80A-120A 是最常用的. 对于蛋白质和聚合物等大分子, 300A, 500A and 1000A (甚

41、至更大) 常被使用. 在大量分析时无孔的硅胶也常使用.,硅胶性质表面积和碳百分率,表面积 如果孔径增加, 表面积降低. 100A : 450 m2/g 150A : 330 m2/g 300A : 100 m2/g 炭含量 碳含量高, 填充物保留能力强. 碳含量为12% -20% 是最常用的,硅胶性质硅羟基,硅羟基,硅羟基容易和硅烷化合物 发生反应.,Cl-Si(CH3)2-R R = C18, C8, C4, Phenyl, C3H7CN, C3H7NH2, Diol,硅胶性质硅烷偶合试剂,单一功能的硅烷偶合试剂 X-Si(CH3)2-R (X=Cl, OC2H5) 多功能的硅烷偶合试剂 X

42、2-Si(CH3)-R (X=Cl, OC2H5) X3-Si-R (X=Cl, OC2H5) 保留时间和灵敏度的不同是由于键合相的不同 硅烷的选择: 单一功能或多功能 键合完全: 部分或完全反应 是否有封端 键合物本身 考虑到重复性，单一功能的硅烷偶合试剂是最常用的,硅胶性质残留硅羟基,残留的硅羟基 甚至对于改良的硅胶 (e.g. ODS, C8), 仍旧有硅羟基保留在表面. 硅羟基对 胺类化合物有强的吸引力, 因而会造成此类物质的拖尾.,硅胶性质 封尾,为了降低硅羟基的影响, 选择 封尾 的柱子,封尾和未完全封尾的比较,Peaks 1. Propranolol 2. Acenaphthen

43、e 3. Ammitriptyline,拖尾的解决,流动相中加入辅助剂 三乙胺 高氯酸钠 (NaClO4) 在流动相中加入胺修饰剂和高氯酸钠有助于减少拖尾 ，因为这些添加物将硅羟基屏蔽了起来.,NaClO4,如果在流动相中填加了胺修饰剂或 TBA 离子对试剂，分析结束后必须清洗柱子 高氯酸钠可以较好的去除胺修饰剂或 TBA 离子，因为高氯酸钠与胺化合物有很强的吸引力. 下面的溶液经常被用来清洗柱子 （含有100 mM 高氯酸钠）0.1%的磷酸水溶液/甲醇= 1 : 1,硅羟基的应用,不同的C-18 柱对植物激素混合物分离的影响,硅胶性质残留的重金属,重金属残留 通常硅胶中含有重金属. 这些重金

44、属和螯合物之间有吸引力, .因而会产生拖尾,可以使用高纯的硅胶类型,纯硅胶型和不纯硅胶型的比较,峰 1. 1,2,3,4-萘四酮,Shim-pack VP-ODS,其他柱,Shim-pack VP-ODS,Shim-pack VP-ODS柱的填充物性质 1)硅粒子 高纯度全多孔, 球形的硅胶粒子 2) 粒径 5 um 3) 孔径120 A 4) 孔容量 1.25 mL/g 5) 表面积 410 m2/g 6)碳含量 20% 7)封尾 使用 8)痕量金属含量最大30 ppm 9)ODS 官能团 单一功能,Peaks 1. N-acetylprocainamide 2. Phenol,Shim-p

45、ack VP-ODS,Others,Shim-pack VP-ODS的质量认证,加入其他有机溶剂,在 甲醇, 乙腈 和 THF之外加入其他溶剂在某些情况下可以改善分离度 乙醚 异丙醚 二氧杂环乙烷 二甲氧基乙烷 cyclohexne oxide 反相分析中，可以加 入约10%的上述物质,摘要- 分离度的改善 -,增加 k,增加 N,改变 a,降低有机溶剂含量. 改变 pH, 缓冲液浓度, 柱温和有机溶剂类型 使用更长的柱子或性能更好的柱子.,HPLC 系统,等浓度洗脱系统 单一溶剂，浓度恒定 梯度洗脱系统 多种溶剂，浓度改变 高压梯度系统 低压梯度系统,等浓度洗脱系统,梯度洗脱系统,等浓度洗脱

46、模式的优化,分析时间长,分离差,MeOH / H2O = 6 / 4,MeOH / H2O = 8 / 2,( 柱 : ODS 型 ),梯度洗脱模式的优化,95%,30%,甲醇浓度,什么情况下选择梯度洗脱?,如果两个相邻的峰在等浓度洗脱模式下，无论条件如何改变都不能得到好的分离 当选择梯度洗脱时，必须确认在等浓度模式两个峰可以分离 梯度洗脱可以在不损失分离度的前提下减少分离时间,梯度洗脱中的平均 k 值 (K),由于梯度洗脱和等浓度洗脱技术都基于HPLC保持和分离过程，因此梯度洗脱程序的设计和等浓度洗脱条件的设计是相似的. 一旦流动相的组成固定, 由其决定的k值也就固定了，那么就可以对梯度洗脱

47、或等浓度洗脱的保留力进行预测. 因而, 分离度可以由下式来描述. Rs = (1/4)(a-1)/aN0.5K/(K+1),梯度曲线,保留时间,溶质在柱中的位置,在梯度洗脱中，对于在柱中移动的溶质分子，k 的平均值 (K) 指其瞬时的k值.,瞬时 k 值,平均 k值 (K),K= tG F / 1.15 Vm DF S tG : 梯度时间 F : 流速 Vm : 柱的死体积 DF : 梯度变化率 S : Isocratic parameter Vm = toF S=100a (log(k) = a(B%) + b,等浓度 梯度,梯度洗脱中每个峰都有相似的半峰宽. 这一点和等浓度 洗脱是完全不同

48、的。虽然 对分离度来说Rs 是非常重要的参数， 在梯度洗脱中，平均 k (K) 实际上是更有意义的。,梯度分离的改善,为了改善分离, 根据下式，a, N 和K 应该被提高 Rs = (1/4)(a-1)/aN0.5K/(K+1) 实际上由于K是最主要的影响因子, K 值应该被增加 (1) 梯度时间 (2) 流速 (3) 梯度改变率 以上因素的改变基于下面的最优化方程 K= tG F / 1.15 Vm DF S,K的初始值,增加流速会使 K值变得更大.然而，由于流速增加会引起高压，所以其增加是有限度的. 开始时，固定流速可能会更好. 梯度时间和 梯度改变率 需要优化. 最初 : K=5 因为

49、k应该在1 至 20 ， 2-10更好, k平均值 (K)开始应该固定在 5,开始梯度比(DF) 和其他参数,由于开始 B的浓度梯度范围应该是从 0%到100% c. 因此，开始的 梯度改变率(DF) 应该是 1. DF = (最后 %-B)-(开始l %-B)/100 = (100%-0%)/100 = 1 柱死体积 (Vm) 4.6 mmID x 15cmL : 1.5 mL 4.6 mmID x 25cmL : 2.5 mL 6.0 mmID x 15cmL : 2.5 mL 流速 (F) : 0.8 - 2 mL/min 等度参数 (S) 分子量 S 100 4 1,000 10 10

50、,000 30 100,000 100,开始梯度洗脱时间 (tG),如果 梯度范围 0% -100% : DF = 1 柱尺寸 4.6mmID x 15cmL : Vm = 1.5 流速 : 1.0 mL/min 样品分子量小于100 : S = 4 K 值 (开始时) : 5 开始的梯度时间应为 23 min. K= tG F / 1.15 Vm DF S 5= tG x 1 / (1.15 x 1.5 x 1 x 4) tG= 5 x 1.15 x 1 x 4 / 1 = 23 min,梯度洗脱时间的优化 (tG),DF = 0.9 (5% -95%) Vm = 1.5 1.0 mL/mi

51、n S = 4 K =5 tG = 5x1.15x0.9x4/1 = 20(min),梯度洗脱浓度范围和时间的优化 (tG),5% -95% (20min),25% -77% (12min),梯度洗脱方法的进一步优化,如果需要进一步的优化, (1) 梯度时间更长(tG) (2) 流速更快 (3) 使用更长或更好的柱子 (4) 改变有机溶剂 (甲醇- 乙腈 - THF),梯度洗脱中的问题 - 1,重复性差 柱子平衡时间不够 通常，柱子再生的时间应该大致等于梯度时间tG. 如果开始的流动相是水或缓冲液，平衡时间要更长. 因此，在开始梯度洗脱时用 5或者更高浓度的有机溶剂比较好 使用自动进样器缩小平

52、衡时间的差异,鬼峰 水的级别低 水中的一些不纯物引起鬼峰. 使用了不纯的水. 降低检测波长可能会检测不到不纯物. 在开始梯度洗脱时用 5或者更高浓度的有机溶剂比较好,梯度洗脱中的问题 - 2,方法认证,准确度 精确度 重复性 中间重复性 重现性 检出限 检测限 线性 回收率 范围 稳定性,判断分析能力的典型参数,范围,定义: 能够给出适当的准确度，精确度和线性的被分析物的高低浓度之间的间隔. 从LOQ 到 线性水平之上,准确度,定义: 试验值和实际值之间的差 评价方法 应该在所有范围内评价准确度. 可以用回收率来进行判定. 要求有3 个以上不同浓度的样品 三次以上的进样.,置信度,置信度意味着

53、我们能用信心指数来进行判定, 也就是置信度范围包括真实值(m)的可能性,.置信度范围的大小 在很大程度上我们对真实值的确信程度，确信程度越高，置信度范围越大,乙酰水杨酸的准确度测试,平均值 (每个级别) dj =,S(yji (100/xj)/m - 100,dj -0.04167 0.18519 -0.16667 -0.33333 0.08333,平均值 (所有级别) d =,SS(yij (100/xj)/mn - 100,置信区间 d - 1.96s/(mn)1/2 , d + 1.96s/(mn)1/2 ,平均值 (d) : -0.03278 置信区间 : -0.14022, 0.07

54、4664,m=level(5), n=repeat(5),线性,定义: 所测样品浓度以及准确度测定的样品浓度应该在线性范围内. 评价方法 应该在所有范围内对线性进行评价 . 可以用回归系数来进行判定. 截距和斜率应该被显示 进行线性确认，应该有5个以上不同浓度的样品被检测,乙酰水杨酸的线性测试,乙酰水杨酸的线性评价,r = 0.999034, a = 0.124, b = 0.9984 相关系数大于0.999,精确度,定义: 相同分析条件下多次测量的数据之间的相近度 三个组分 重复性 中间精密度 重现性,重复性,通过对相同样品的多次进样来测量表达HPLC系统的性能 评价方法 用 RSD来表达,

55、 由一种样品在相同条件下多次测定组成. 重复性应该在所有范围内进行评价 最少进样5次,乙酰水杨酸的重复性测试,标准偏差 (每个级别) sj =,S(yji - S yji/m)2/(m-1)1/2,相对标准偏差 (每个级别) RSDj =,sj / (Syji/m),m=level(5),RSD(%) 0.73 0.67 0.72 0.69 0.63,中间精密度,估算方法的可靠性不同于方法的开发。 在日间，不同的实验者之间，不同仪器间的测试等 当方法开发结束后，确认对于相似的样品方法能提供相同的结果 评价方法 用 RSD来表达， 最少两个不同场合的数据来确认方法的精密度,乙酰水杨酸的中间精密度

56、测试,SD 0.717635 0.605805 RSD 0.72(%) 0.61(%),F(F-test) = s12 / s22 = 0.7176352 / 0.6058052 = 1.1846,自由度 = 4 1.1846 9.605 (P=0.05),在5水平时这两种测试方法的不同有重要的意义,重现性,定义: 重现性是指在合作研究的实验室之间的精密度,检出限 定量范围,检出限 可以检测出的最低浓度, 不要求定量. 检测限 可以接受的精确度和准确度时可以确定的最低检测浓度 评价方法 信噪比法 标准偏差和校准曲线法,检出限: S/N= 2 (or 3) 定量限 : S/N=10,信噪比,信噪比,50ppm : S/N=200mm/1mm=200 ? ppm : S/N=2,(N = 1mm),(S = 200mm),浓度=50 ppm