《生物化学》教学课件：DNA Recombination20131128txw

1、第五节 DNA重组,DNA重组是指由于不同DNA链的断裂和连接而产生的DNA片段的交换和重新组合，形成新的DNA分子的过程。,重组的类型： （1）同源重组 (homologous recombination ) ： 大片段同源DNA序列之间的交换。 交互重组：发生在真核生物减数分减过程中； 单向重组：发生在细菌中转化、接合和广泛性 转导中的，即仅使受体发生重组，供体并未发生改变。 其主要特点是需要RecA蛋白的介入。,（2）位点特异性重组（site-specific recombination）： 重组发生在特殊位点上，此位点含有短的同源序列，供重组蛋白识别。 特点： 发生在特异位点； 需蛋白

2、的催化； 涉及交错切割。 最为典型的是噬菌体在att位点整合E.coli的基因组中。,（3）转座重组（transposition recombination） ： 转座的机制依赖DNA的交错剪切和复制，但不依赖于同源序列。 转座涉及转座酶，解离酶和DNA聚合酶， 分为复制型、非复制几种类型。 转座的过程中会形成共合体。 两个转座因子之间的重组会引起缺失和倒位。,一）同源重组,1.1 同源重组（homologous recombination）: 发生在同源DNA序列之间。,1 特征,1.2 进行同源重组的基本条件：,在交换区具有相同或相似的序列：涉及同源序列间的联会配对，且交换的片段较大；单链

3、DNA分子或单链DNA末端是交换发生的重要信号 双链DNA分子之间互补碱基进行配对 重组酶 异源双链区的形成:涉及DNA分子在特定的交换位点发生断裂和错接的生化过程；存在重组热点。,细线期,合线期,粗线期,双线期,终变期,e.g. Euk.减数分裂时的染色单体之间的交换；细菌的转化，转导，接合，噬菌体重组,同源重组是同源依赖性的，而非序列依赖性。所以任何两个具有同源性的DNA分子可以通过此过程进行重组。 同源重组有两个基本功能：遗传混合和DNA修复。 同源重组见于减数分裂时的染色体分配，DNA修复，转座等过程。,2 同源重组的机制,2.1 断裂复合及Holliday中间体的形成, Hollid

4、ay结构 同源重组中连接两个DNA双链的交换中间物含有4股DNA链， 在连接处为了转换配对所形成交叉链的连接点为, Holliday结构形成的分子机制（断裂复合起始机制）,有Holliday双链侵入模型、单链侵入模型、双链断裂修复模型等多种, 同源重组都涉及到DNA分子内的断裂复合,2.2 分枝迁移和Holliday结构的拆分,1）分枝迁移（branch migaration） 双螺旋形成的交叉连接以拉链式效应扩散,2）Holliday的异构化,产生重组体的拆分,Holliday结构一经生成即可 不断地处于异构化异源双链 heteroduplex DNA,重组结果取决于拆分时 配对链上的切口位

5、置,Holliday中间体的拆分,1，2切割,3，4切割,DNA内切酶,DNA内切酶,DNA内切酶,DNA内切酶,产生含异源双链的亲本DNA分子 (Patch recombinant),产生重组体 (Splice recombinant),“亲本链 (Patch recombinant)”,“重组体(splice recombinant)”,Holliday双链入侵模型全过程,二）大肠杆菌重组的分子基础,细菌（E.coli）转化中的重组-基因转移,细菌的接合作用(conjugation) 细菌的细胞相互接触时遗传信息可以由一个细胞转移到另一个细胞。 细菌的遗传转化(genetic transf

6、ormation) 指细菌品系由于吸收了外源DNA(转化因子)而发生遗传性状的改变现象。 细菌的转导(transduction) 通过噬菌体将细菌基因从供体转移到受体细胞的过程。 细菌的细胞融合(cell fusion) 形成原生质体 进入受体细胞(recipient cell)的外源基因有四种结果： 降解、暂时保留、与内源基因置换和发生整合。,发生在双方DNA的同源区域；,部分复制的染色体DNA之间或染色体DNA与外源DNA之间 细菌的转化、结合和转导。,2 RecBCD（外切核酸酶）和 Chi 位点 2.1 活性, 具有解旋酶（再旋）活性、ATPase活性、核酸外切酶活性、 序列特异性的单

7、链内切酶活性；, 单链内切酶活性和解旋酶活性使DNA产生具有游离末端的单链 RecA的作用位点；, RecBCD有固定切割位点；,2.2 RecBCD的作用过程,a、RecBCD结合在DNA的平 头末端（产生机制不清楚）,b、 外切、解链、移动 （ATP）,c、兔耳状 loop 结构产生 （再旋酶活性低于解旋酶活性）,d、RecBCD 在 loop 单链区的 chi 位点3方46NT处 切断单链（单链内切酶）, chi位点：GCTGGTGG 目前发现的重组热点 E.coli 含 1009 个、Euk.,e、RecBCD 切割产生3单链末端,3 RecA 蛋白,RecA有两个主要的功能：诱发SO

8、S反应和促进DNA单链的同化(assimilation) 。 单链同化：即是指单链与同源双链分子发生链的交换，从而使重组过程中DNA配对、Holliday中间体的形成，分支移动等步骤得以产生。 3.1 活性,a、 RecA 有单、双链 DNA 结合活性;,b、 RecA 有 NTPase 活性（底物差异活性）， 与单链 DNA 结合时活性最大-依赖于 DNA ；,c、 RecA 有启动一个分子的单链侵入到另一双螺旋分子 的能力，即联会同源 DNA； （但其靶 DNA 必须有缺口结合DNA）。,RecA蛋白相对分子质量为38000，与单链DNA结合形成的螺旋纤丝每圈含六个单体。,3.2 作用过程

9、：,1）RecA蛋白与单链DNA的结合 2）联会：单链与双螺旋的互补链迅速配对，形成双链连接分子Holliday（5侵入）。 3）联会后链交换：启动双链DNA分子的一条链的替换和新链的同化。 交换速度大约为6 bp/s，其方向是。 当新的杂交双链形成时，RecA蛋白即从原来的单链掉下来。 RecF、RecO和RecR蛋白调节RecA纤丝的装配和拆卸。,RecBCD和RecA 的共同作用,3.3 原核同源重组的其它蛋白,需要 E.coli 中三个基因 ruvA,ruvB 和 ruvC 的产物：,a、 RuvA 识别 Holliday 结构的连接点；,b、 RuvB 为分枝迁移提供动力（ATPas

10、e 1020bp/s）；,c、 RuvC 核酸内切酶-专一性识别 Holliday 结构的连接点体外切段连接点以拆分重组体。,d 、RecG解旋酶也具有解离Hollidy连接的活性，使重组得以完成。,E.coli 重组的各阶段 （损伤修复）,损伤DNA复制产生缺口,RecA链交换,第二次链交换,DNApol通过DNA合成填满缺口,RuvA,B分枝迁移,RuvC切割Holliday连接点,三）位点特异性重组,1 位点特异性重组（ site-specific recombination）,发生在专一序列而顺序极少相同的DNA分子间的重组。,噬菌体基因组整合到细菌染色体基因组中属此种重组,特征：,

11、在特定的结合序列部位，有专一的酶催化断裂重接 -产生精确的DNA重排；, 都具有整合作用的两个基本特征：,a、典型的保守性重组-交换是相互的和保存原先的DNA,b、发生在噬菌体和细菌DNA短同源序列的特异性核苷酸上,Euk. 中专一性抗体基因的构建。,2 DNA的整合与切除,2.1 实现机制：,均是通过-细菌DNA和DNA上特定位点之间的重组,2.2 特定位点-附着位点（attachment site att）, E.coli attB 含BOB三序列 23bp, DNA attP 含 POP三序列 240bp, 核心序列 “O”完全一致 15bp （同源部分） -位点特异性重组发生的地方,

12、B,B,P,P-臂,2.3 整合和切离过程, 整合后的附着位点为 attL（BOP） attR（POB）, 整合位点-attB、attP 切除位点-attL、attR, 依赖蛋白: 整合过程需要整合酶（integrase Int）（编码）和寄主的整合宿主因子IHF（integration host factor）共同作用。 切离反应需要噬菌体Xis基因的产物以及Int和IHF。,1) 整合酶(integrase) 噬菌体int基因编码 功能：识别POP和BOB 结合 与POP结合 拓扑异构酶I活性 2)整合宿主因子（IHF) （integration host factor） 细菌基因编码 功

13、能：促进整合酶与POP和BOB结合。 3)切除酶（excisonase） 噬菌体xis基因编码 功能：与整合酶结合后识别POB和BOP,切割O序列，重新形成POP和BOB。 4)逆转刺激因子（FIS） 功能：参与切除过程。,2.4 整合分子机制, 核心序列O全长15bp，富含A-T, 发生在O内的重组交换位点相距 7bp。, 整合酶的结合位点：attP 240bp、attB 23bp(两者的作用不同)。, attP位点的负超螺旋为重组所必须-加强了Int和IHF的亲和力 -高剂量的蛋白维持单链重组所必需的结构。, Int结合： -核心序列的反向位点（切割位置） -结合在att臂上（臂与核心区靠近）,attB和attP的最初识别靠Int识别两序列的能力； 两序列的同源性在链交换时为重要因素。,Int蛋白能切断DNA，并使它重新连接，近而使holliday结构拆分； 重组时attP和attB部位交叉断裂，互补单链末端进行交叉杂交。,复习题,名词解释 同源重组 位点专一性重组 Holliday 结构,问答题 遗传重组有几种重要的形式？ 同源重组的简单过程及Holliday结构形成的分子机制。 细菌同源重组涉及的主要酶系及各自在重组中的功能为何。 DNA的整合与切除的分