RTPCR(包括引物设计).ppt

1、,实时荧光定量PCR技术的原理及应用 (Real time Quantitative PCR) 中山大学中山医学院,内 容 提 纲,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量技术的应用,PCR： 国王和象棋的故事,N = 264 -1 = 18446744070309551615,PCR：伟大的天才发明,PCR原理简介,PCR：理想与现实,反应效率差异的累积使终点定量几乎不可能 终点检测，与看家基因对照，所谓 半定量：不可接受。,实时荧光定量PCR定义,在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测

2、整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法,实时荧光定量PCR原理定量原理,介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值,如何对起始模板定量？,通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析,通过看家基因和目的基因的Ct值进行相对定量,实时荧光定量PCR 原理 - 扩增曲线,实时荧光定量PCR 原理 -荧光阈值,荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍 手动 设置：原则要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进

3、入指数期的最初阶段，并且保证回归系数大于0.99 真正的信号:荧光信号超过域值,实时荧光定量PCR 原理 -Ct值,Ct值的定义： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数,实时荧光定量PCR 原理 -Ct值的重现性,Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，终点处产物量不恒定； Ct值则极具重现性,实时荧光定量PCR 原理 - 定量原理,理想的PCR反应： X=X0*2n 非理想的PCR反应： X=X0 (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率,实时荧光定量PCR 原理 - 标准曲线,模板DNA量越多，荧

4、光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量,确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量,实时荧光定量PCR原理 绝对定量,以各自样本中内参（housekeeping）基因为标杆， 比较两样本中目的基因的相对丰度,- Ct法 成立条件：内参基因 (houskeeping gene) 在相互比较的样本之间表达丰度相同 满足条件：内参基因和目标基因的扩增效率接近 - 正负10%,实时荧光定量PCR原理 相对定量,讲 座 提 纲,实时荧光定量PCR原理 实

5、时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用,非特异性荧光标记： 1、 SYBR Green 特异性荧光标记： 2、TaqMan,实时荧光定量PCR - DNA 产物的荧光标记,如 何 选 择？,实时荧光定量PCR 方法 1 -SYBR Green 法,SYBR Green,SYBR Green 法 工作机理,SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位,SYBR Green 只有和双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYB

6、R Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。,SYBR Green,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 工作原理,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析,实时荧光定量PCR原理 SYBR Green I 熔解曲线分析,将温度与荧光强度的变化求导。(-dI/dT),Tm,SYBR Green 法 融解曲线分析,SYBR Green 法 优缺点,实时荧光定量PCR 方法2 -TaqMan法,TaqMan-水解型杂交探针,5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的

7、荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针,TaqMan法 工作原理,每扩增一条DNA分子，释放一个荧光信号，可以在循环过程中任一点检测荧光,TaqMan法 优缺点,讲 座 提 纲,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用,实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR实验设计及应用,实时荧光定量PCR法 染料法举例,SYBR Green法研究CDK6 在 肺癌组织标本中的表达差异,实验步骤,流程示意图,TaqMan法举例 材料准备,从正常肺组织中提取的总 RN

8、A 从肺癌组织中提取的 总RNA,-Trizol -裂解液 （氰酸胍，异硫氰酸呱， SDS） -液氮 -RNA保存液 小心DNA污染！ -使用DEPC处理相关器材,最常用,反应体系,dNTPMixture (dATP、dCTP、dGTP和dTTP) DEPC H2O,下游应用：是否检测其它基因？ 检测何种剪接体？ 是否会有二级结构干扰？ 检测灵敏度是否足够？,逆转录,逆转录引物选择,常用,一步法 or 两步法？,两步法：步骤多但灵活多样。cDNA可长期保留检 测多个基因。便于反应优化。 推荐：工作的初期阶段,RealSYBR 二步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX,RealSYBR 一步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX,RealSuper 二步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX,一步法：简便、快捷但只做一个基因，一旦失败 难以查找原因。 推荐：工作的成熟阶段 （实际上：不推荐）,RealSuper 一步法荧光定量PCR试剂盒/With ROX,PCR体系Master mix的选择,DNA聚合酶 Primers Dye Buffer and dNTPs Template,Real-time PCR,cDNA,关键,Real-time PCR,总原则与普通PCR相同 避免引物二聚体，避免二级结构 尽量小些 （70 -