RealTime_PCR原理、应用及数据分析.ppt_第1页
RealTime_PCR原理、应用及数据分析.ppt_第2页
RealTime_PCR原理、应用及数据分析.ppt_第3页
RealTime_PCR原理、应用及数据分析.ppt_第4页
RealTime_PCR原理、应用及数据分析.ppt_第5页
已阅读5页，还剩27页未读， 继续免费阅读

下载本文档

版权说明：本文档由用户提供并上传，收益归属内容提供方，若内容存在侵权，请进行举报或认领

文档简介

1、Real-Time PCR原理、应用及数据分析,原 理,Real-Time PCR 是指在PCR反应体系中加入荧光基团, 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分析。,荧光基团？,SYBR Green I TaqMan probe,实时检测？,Threshold：在扩增曲线的指数增长区域内适当位置上设定的荧光检出界限。 CT value： 每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数。,定量？,定量？,通过已知浓度的标准品制作的标准曲线对未知浓度的样品进行定量分析。,Real-Time PCR vs. 常规 PCR

2、,常规PCR结合电泳分析方法的缺点 检测终产物,对起始模板定量不准确 EB的敏感性低,Real-Time PCR分析方法的优点 对起始模板定量准确 SYBR的敏感性高,应 用,基因表达差异分析 神经病理性痛模型中IL受体基因在脊髓背角的变化 DNA 或RNA 的绝对定量分析 病原微生物或病毒含量的检测 转基因拷贝数的检测 RNAi 基因失活率的检测等,引物设计,NCBI查找需要的目的基因的序列,Takara公司 金斯瑞公司 一般需要1周,标准品的制备,RNA样品定量标准品 Total RNA & cDNA 体外转录体外转录RNA PCR产物或质粒 标准品梯度的选择：56个梯度 标准品稀释倍数的

3、选择：标准品稀释倍数通常10,理想的标准品扩增曲线,基线平整基线平整 Negative control为水平线 指数区较明显，陡度大 平台区汇于一起 线性范围宽,数据分析,绝对定量 试验最终结果要求精确到拷贝数水平试验最终结果要求精确到拷贝数水平 标准曲线法,相对定量 比较CT值法,假设目的基因与管家基因扩增效率相同且等于100%时,即实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数,CT=(CT目的基因-CT管家基因)实验组-(CT目的基因-CT管家基因)对照组,CT=(CT目的基因-CT管家基因)实验组-(CT目的基因-CT管家基因)对照组,绝对定量v.s.相对定量 绝对定量 优点：给出的是目标基因的绝对数量，数据容易处理 缺点：必须有标准品；标准品必须准确测定，难以制备和质控 相对定量 优点：可以不做标准品；使用广泛 缺点：数据理解困难,CT,需要注意的问题,防止Genomic DNA污染,Total RNA 用DNase I消化。,样品进行均一化,目的基因和管家基因一起扩增。,检验扩增产物的特异性,分析目的基因的融解曲线,保证扩增效率的一致 扩增产物长度：75-200bp 管家和目标基因地扩增长度要接近 引物设计特异，退火温度一致 模板纯度、复杂度等 反应条件优化,一个样本同次扩增要做3个复孔，取平均

人人文库> 全部分类> 教育资料 > 作文作品

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明，都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等，如果需要附件，请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸，网页内容里面会有图纸预览，若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间，仅对用户上传内容的表现方式做保护处理，对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑，并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容，请与我们联系，我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

最新文档

评论

0/150

提交评论