21药物的现代分析方法

1、第二十一章药品质量控制中现代分析方法的进展,药物分析中最常用的分析方法是,色谱分析法 光谱分析法 色谱光谱分析法联用技术,其中 色谱分析法主要应用毛细管GC、高效液相色谱法、高效毛细管电泳法 光谱分析法主要应用四大波谱,毛细管电泳及其应用 超高效液相色谱及其应用 手性HPLC技术与应用 GC-MS技术与应用 LC-MS技术与应用 液相色谱-核磁共振联用技术,本章主要内容,（一）简介 以高压电场为驱动力，以毛细管为分离通道，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离的一种液相分离技术 电泳是电解质中带电粒子在电场作用下向电荷相反方向迁移的现象，利用这种现象对物质进行分离分析的方法，称之

2、为电泳法 在散热率很高的毛细管内进行的电泳分析，称为毛细管电泳法,第一节 毛细管电泳及其应用,主要特点,高效：n 高达数十万块/米，甚至数百万块 高速：可在3分钟内分离30种阴离子；1.7分钟分离19种阳离子; 4分钟可分离10种蛋白质 微量：仅需 nL（10-9 L）级的进样量 仪器简单，低消耗：分析一个试样仅需几毫升流动液 采用空心毛细管，不易产生柱污染 检出灵敏度和精密度均不及HPLC,（二）基本装置与原理,电压：030KV 分离柱 不涂敷任何固定液 紫外或激光诱导荧光检测器 （可检测：10-1910-21 mol/L）,1 基本装置,2 基本原理,带电粒子在电场作用下，以不同速度向其所

3、带电荷相反的电场方向迁移的现象，称为电泳，速度 vep 单位电场下的电泳速度称电泳淌度,电泳及电泳淌度,显然，淌度是粒子在单位电场强度、单位时间内移动的距离, 对于给定的介质和离子，淌度是该离子的特征常数,对于球形离子，淌度与该离子的半径 r、电荷q及溶液粘度有关,由于玻璃表面存在硅羟基，pH3时, 形成双电层，在高电场的作用下水合阳离子带动整体溶液向负极移动的现象称为电渗，速度veo,单位电场下的电渗速度称电渗淌度,因电渗现象引起的液体流动叫电渗流,电渗及电渗流,带电粒子的迁移速度 vap 电泳和电渗流两种速度的矢量和,石英毛细管：带负电荷。电渗流流向阴极，通常 veo 约为vep 的 57

4、 倍,正离子： 两种效应的运动方向一致，最先流出 中性粒子: 无电泳现象，只受电渗流影响，在阳离子后流出（不被分离） 阴离子： 两种效应的运动方向相反,最后流出,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样 被相互分离,HPCE中电渗流的流形,电荷均匀分布，整体移动，电渗流的流动为平流，塞式流动（谱带展宽很小） 液相色谱中的液流为抛物线流型，管中心处的速度为平均速度的2倍（谱带展宽较大）,（三）主要分离模式,最基本、应用最广的分离模式,1 毛细管区带电泳 CZE,2 胶束电动毛细管色谱 MECC,在缓冲溶液中加入超过临界浓度的表面活性剂，形成荷电胶束，在电场力的作用下，胶束在柱中移动,系

5、色谱与电泳分离模式的结合，中性分子在胶束相和溶液（水相）间分配，疏水性强的组分与胶束结合的较牢，流出时间长,用于分离中性物质，扩展了高效毛细管电泳法的应用范围,凝胶具有多孔性，类似分子筛的作用，使试样分子按大小分离。能够有效减小组分扩散，所得峰型尖锐，分离效率高 蛋白质、DNA等的电荷/质量比与分子大小无关，用CZE模式很难分离，采用CGE能获得良好分离，DNA排序的重要手段。,3 毛细管凝胶电泳 CGE,特点： 抗对流性好，散热性好，分离度极高。 无胶筛分技术：采用低粘度的线性聚合物溶液代替高粘度交联聚丙烯酰胺。柱便宜、易制备。,毛细管内充有两性电解质（合成的具有不同等电点范围的脂肪族多胺基

6、多羧酸混合物），当施加直流电压（68V）时，管内将建立一个由阳极到阴极逐步升高的pH梯度 氨基酸、蛋白质、多肽等的所带电荷与溶液pH有关，在电场力的作用下迁移，分别到达其等电点pH位置时，呈电中性，停止移动，由此可使它们得到分离 可分离等电点差异小于0.01pH单位的两种蛋白质,根据等电点差别分离生物大分子的高分辨率电泳技术,4 毛细管等电聚焦 CIEF,5 毛细管电色谱 CEC,在毛细管壁上键合或涂渍高效液相色谱的固定液，以电渗流为流动相，试样组分在两相间的分配为分离机理的电动色谱过程,毛细管等速电泳（CITP） 微芯片毛细管电泳（microchip electrophoresis）,（四）

7、高效毛细管电泳应用与进展,一、离子分析 （CZE/MECC） 二、药物及代谢产物、生物材料分析 三、手性化合物分析 四、氨基酸分析 五、肽、蛋白质、核酸分析及DNA测序 六、单细胞、单分子监测,采用MEKC模式，鉴定违禁药物；,Click to add title in here,自20世纪70年代以来，随着高效液相色谱 (High Performance Liquid Chromatography，HPLC)技术的不断发展，美国Waters公司于2004年的匹兹堡会议上推出了最新研制的ACQUITY超高效液相色谱(Ultra Performance Liquid Chromatography

8、，UPLC)，其采用17 Ixm细粒径的新型固定相，可获得高达2万块m理论塔板数的超高柱效，并以系统整体设计的创新技术，全面提升了液相色谱的速度、灵敏度和分离度，造就了液相色谱性能上的飞跃和进步并形成分离科学的一个新兴领域。,第二节 超高效液相色谱,超高效液相色谱 （UPLC）的原理,UPLC的理论基础为： 范德米特(Van Deemeter)方程,HETP=A(dP)+Bv+Cu(dP)2,HETP：理论塔板高度 A：涡流扩散系数,由该方程可得出结论： 颗粒度越小柱效越高；每个颗粒度尺寸有自己的最佳柱效的流速；更小的颗粒度使最高柱效点向更高流速(线速度)方向移动，而且有更宽的线速度范围所以降

9、低颗粒度不但提高柱效，同时也提高速度。,dP：填料粒径 B：分子径向扩散系数 C：传质因子为流动相线速度,van Deemter曲线的提示,如果填料的颗粒继续演变,未来的色谱:更小的颗粒度,液相色谱30年的发展史是颗粒技术的发展史。颗粒度的改变直接影响到柱效，从而对分离结果产品直接影响。由上图可知：随着颗粒度的不断降低，色谱分离度不断提高。,小颗粒分离的理论与科学基础,更小颗粒度所面临的挑战,Click to add title in here,小颗粒带来生产力,-UPLC的优点,超高分离度,UPLC与HPLC：分离度比较,由下图可见：UPLC可以大大提高分离度，同时色谱峰强度也得到了提高。,

10、小颗粒带来生产力,-UPLC的优点,超高速度,图4: UPLC与HPLC：速度比较,图5：UPLC美国药典有关物质分析实例,原有HPLC分析需要4个不同的方法、三根不同的色谱柱，至少需要65分钟才能完成；UPLC使用了一根色谱柱、一种简单方法，在1分钟内即可完成。,小颗粒带来生产力,-UPLC的优点,超高灵敏度速度,图6: HPLC到UPLCTM：灵敏度的改善无需折衷,UPLC使用小颗粒技术可以得到更高的柱效（因而改善了分离度）、更窄的色谱峰宽，即更高的灵敏度。,与UPLC匹配 的色谱柱比较少,峰面积的重复性欠佳,对高频检测仪器的需要,超高效液相色谱的局限性,尽管UPLC能显著减少复杂样品的分

11、析分离时间，提高检测的灵敏度和分离度，但目前UPLC的使用仍然存在局限性，其普及应用可能仍然需要一些时间。,色谱柱要能够耐受由于粒径减小而带来的高反压，而且粒径的减小也给色谱柱充填技术带来了挑战。,UPLC分析样品时峰面积的重复性略逊于HPLC，特别是低浓度样品时更加明显，其峰面积重复性的RSD约为HPLC的2倍。,UPLC分离样品色谱峰扩展很小，通常峰底宽度只有几秒钟，低浓度的样品峰则更窄。使用UPLC测定低浓度样品时，准确度、精密度都比较差。,第三节 手性HPLC技术与应用,（一）概述,手性药物现状,1 对某些手性药物进行对映体的纯度检查； 2 生物体液中药物对映体的分离分析研究可探索血药

12、浓度与临床疗效的关系； 3 在研制手性药物过程中，可分别评价单个对映体的效价、毒性、不良反应以及药动学性质； 4 必要时，可进行手性药物对映体的制备分离（或拆分）,手性色谱分离的意义,（二）手性药物拆分方法的机理,引入不对称中心（或光学活性分子）把手性混合物转换成为非对映异构体，然后利用其化学或物理化学性质的差异使之分开,色谱法拆分机理,三点手性识别模型,手性选择剂,HPLC 拆分法,采用手性固定相或在流动相中加入手性添加剂，分离分析立体异构体的方法 一般手性固定相与其相反构型的对映体之间作用力强，易形成瞬间非对映体“配合物”，使手性组分得到保留 手性固定相系将手性官能团键合在载体上而成,（三

13、）手性HPLC 拆分法分类,1 间接法 手性衍生化试剂(CDR)法,2 手性流动相拆分法（直接法） CMP,3 手性固定相拆分法 CSP,柱前手性衍生化反应的注意事项 手性试剂必须是高光学纯度的试剂 衍生化反应要定量完成（90-100%） 手性待测物必须具有可反应的活性基团 如 -NH2、-OH、-COOH 等 手性试剂及产物应稳定，且具有不同的紫外或荧光特性 生成的非对映异构体应具有较高的柱效,1 间接法 手性衍生化试剂(CDR)法,手性衍生化反应,SE 光学活性试剂，也称“选择剂” SA 手性溶质，也称“选择靶”,如 醇类与手性酸或酰氯 酯化,可使用价格便宜、柱效较高的非手性柱 通过衍生化

14、反应可提高检测灵敏度 衍生化过程可同时纯化样品 缺点 需要高纯度的手性衍生化试剂 操作复杂费时，有时需严格控制反应时间和温度,优点,在流动相中加入手性添加剂，使其与待测物形成对映异构体复合物，依据复合物的稳定常数不同以及药物与结合物在固定相上分配的差异而得到分离,2 手性流动相拆分法（直接法） CMP,常用手性添加剂 配基交换型手性添加剂（CLEC） 用于分离氨基酸及其衍生物、多巴胺 环糊精(CD)类添加剂 常用-CD，CD、改性CD 手性离子对络合剂 常用(+)-10-樟脑磺酸、奎宁和奎尼丁,利用手性固定相与对映体消旋物相互作用，生成不稳定的短暂的对映体复合物，使两种异构体在色谱柱上的保留时

15、间不同，从而得到分离,3 手性固定相拆分法 CSP,常用的手性固定相,Pirkle型手性固定相 - 碱型手性固定相、 - 酸型手性固定相和氨基酸类手性固定相 蛋白质类手性固定相 环糊精键合相 手性聚合物固定相,CSP 特点,适用范围广 制备分离方便 定量分析的可靠性高 价格昂贵,（四）CDR、CMP 和CSP 的比较,拆分实例 酰胺型手性固定相直接拆分克仑特罗对映体,色谱柱：Chirex 3005手性色谱柱（R）-1-萘基甘氨酸和3,5-二硝基苯甲酸共价键合） 流动相：正己烷:二氯乙烷:甲醇54:38:8（V/V/V） 流速：1ml/min 检测波长：247nm 柱温：17,（1）克仑特罗分子

16、上的NH与固定相萘乙基酰胺部分的C=O形成氢键作用； （2）克仑特罗分子上的OH与固定相3,5-二硝基苯甲酰胺的NH形成氢键； （3）克仑特罗分子上的芳基与固定相上的3,5-二硝基苯基之间的电子授受作用力因对映体的构型不同而不同，（）-S构型对映体的空间位置有利于电子授受力的形成，而（）-R构型对映体上的芳基与3,5-二硝基苯基的距离远，不易发生上述作用。,所以，由于空间构型的不同，使得S构型的对映体有利于“三点相互作用”的形成，与固定相的作用力强，保留时间也长，后洗脱出来；而R构型的对映体仅能形成“两点作用”，故而在柱上的保留时间短，先出峰。,克仑特罗与酰胺型手性固定相的相互作用拆分机理,第

17、四节 GC-MS 技术与应用,以 GC为分离手段，以 MS为检测手段的分离分析方法,1 定性参数多，结果可靠；不仅有tR，还有质谱图 2 定量精度高 3 检测灵敏度高 4 分析方法建立容易：GC 法有大量文献,方法特点：,（一）GC-MS联用仪的组成,1 色谱柱 毛细管柱 2 接口 联用技术中的关键装置 接口的作用 使柱出口压力与质谱离子源的压力相匹配 减小流量，分离除去大量的载气，保留或浓缩样品组分,要求 载气 氦气 or 氢气 柱出口流量 1ml/min,（1）直接导入型,（2）分流型接口,（3）浓缩型 喷射式分子分离器,（1）电子轰击电离源（EI） 特点： 稳定，操作方便；电离效率高，结

18、构简单，重现性好,3 离子源,电子轰击离子化(electron impact ionization，EI)EI是最常用的一种离子源，有机分子被一束电子流(能量一般为70eV)轰击，失去一个外层电子，形成带正电荷的分子离子(M+)，M+进一步碎裂成各种碎片离子、中性离子或游离基，在电场作用下，正离子被加速、聚焦、进入质量分析器分析。,特点： 分子离子峰强度大，易得到分子量信息；谱图简单；不适用难挥发试样,（2）化学电离源（CI）,化学离子化(chemicalionization，CI)将反应气(甲烷、异丁烷、氨气等)与样品按一定比例混合，然后进行电子轰击，甲烷分子先被电离，形成一次、二次离子，这

19、些离子再与样品分子发生反应，形成比样品分子大一个质量数的(M+1) 离子，或称为准分子离子。准分子离子也可能失去一个H2，形成(M-1)离子。,（二）定量方法,1 总离子流色谱 TIC 将质谱仪每次扫描的质谱峰的离子流全部加合，以总离子流强度对时间作图所得的谱图称作总离子流色谱,TIC图一般与GC谱图是一致的,2 选择离子检测（SIM）,质谱仪只对某个（或几个）指定m/z 的离子进行反复自动扫描，用保留时间为横坐标，记录特征离子碎片的强度所构成的质量图谱，可以实现选择性地测定复杂样品中的某一组分的含量 SIM 比 TIC 的灵敏度高2-3个数量级,案例：气相色谱 - 质谱联用法检测保健品中的违

20、禁药物,近年来 , 保健品市场日益兴旺 , 但暴露出来的问题也十分严重。添加违禁合成药物、假化学成分达到或增加其功效作用的行为更具隐蔽性、欺骗性和危害性 , 为一般消费者所难以识别。因此 , 开展保健品的安全检测十分必要。 保健品成分十分复杂 , 目前常规的检测手段难以鉴别出各种添加的违禁药物 , 本文应用气相色谱 -质谱联用方法对一批问题保健胶囊进行了准确的定性分析 , 检测出布洛芬、非那西丁等 8种违禁添加药物以及布洛芬甲酯、3-氯苯酰胺等 6种药物中间体或分解物。,HP6890/5973气相色谱 -质谱联用仪（ EI源）,布洛芬、非那西丁、地巴唑、服他灵、安定、利心平、胃复宁、消炎痛 8

21、种为违禁添加的合成药物 另外 6种药物可疑中间体或分解产物四氯苯甲酸、布洛芬甲酯、3-氯苯酰胺、9-氯氮蒽、双氯酚酸甲酯、2 -2, 6-二氯苯 -氨基 -苯乙酸, 长期摄入 对身体健康无疑是有害无益的,（一） 概述 方法特点： 适用范围广 检测灵敏度高 可提供结构信息 高样品通量 缺点：,第五节 LC-MS 技术与应用,对部分化学成分响应差 对色谱流动相组成有限制,作用 将液相洗脱液及样品气化 分离除去大量的洗脱液 使样品分子离子化,（二）接口,API 主要包括,大气压电离技术（API）,1 ESI 接口（电喷雾离子化）,流出液在高电场下形成带电喷雾，在电场力作用下穿过气帘 气帘的作用：雾化；蒸发溶剂；阻止中性溶剂分子,通常只产生分子离子峰，故可用于不稳定的极性化合物 能形成多电荷离子，可用于分析分子量达几十万 u 的化合物 可用于流速 1ml/min,ESI 的特点,在 ESI 接口基础上，增加了APCI 蒸发器和电晕放电针