专题1基因工程12基因工程的基本操作程序修改.ppt

1、1.2基因工程的基本操作程序,第一步：目的基因的获取,第二步：基因表达载体的构建,第三步：将目的基因导入受体细胞,第四步：目的基因的检测与鉴定,有了目的基因，才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。,单独的DNA片段目的基因，是不能稳定遗传的。,含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞，并且维持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。,目的基因导入受体细胞后，是否可以稳定维持和表达其遗传特性，只有通过检测与鉴定才能知道。,1.从自然界中已有的物种中分离出来，如从基因组文库或cDNA文库中获取。,3.利用PCR技术扩增目的基因 通过PCR技术可对已获取的目的基因进行扩增，以获取大量

2、的目的基因。,2.人工合成目的基因 常用的方法有反转录法和化学合成法（DNA合成仪）。,一、目的基因的获取,（一）目的基因： （二）获取方法：,主要是指编码蛋白质的基因。,mRNA,互补DNA (cDNA),双链DNA (即目的基因),反转录,合成,以目的基因转录成的mRNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在DNA聚合酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。,mRNA反转录成cDNA,蛋白质的 氨基酸序列,mRNA的 核苷酸序列,目的基因 核苷酸序列,目的基因,根据已知的氨基酸序列合成DNA：,化学合成目的基因,从基因文库中获取目的基因,1. 基因组文库,基因文库：将含有某种生物不

3、同基因的许多片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。,受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群体称为这种生物的基因组文库。,2. 部分基因文库,受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库，如cDNA文库。,基因组文库含有一种生物的全部基因，而cDNA文库指含有一种生物的部分基因，二者都是基因文库；有了基因文库，就可随时从中提取所需要的目的基因，导入受体细胞使之表达。,用适当 限制酶切割,与载体连接 导入受体菌群,与载体连接 导入受体菌群,基因文库的构建,（1）基因组文库的构建,提取某生物 全部DNA,许 多 DNA片段,该

4、生物基 因组文库,（每个受体菌含有一段不同的DNA片段）,（2）cDNA文库的构建mRNA反转录形成,该生物 cDNA文库,mRNA （某种生物发育的某个时期的）,互补DNA (cDNA),双链DNA (即目的基因),基因组文库和部分基因组文库(cDNA文库)比较,（1）基因文库组的构建方法,通过对受体菌的培养而储存基因,1、原核细胞的基因结构,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,启动子：一段有特殊结构的DNA片断，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。 终止子：位于基

5、因的尾端的一段特殊的DNA片断，能终止mRNA的转录。,不能转录为信使RNA，不能 编码蛋白质。,：能转录相应的信使RNA，能 编码蛋白质,编码区,非编码区 （含启动子和终止子等）,原核细胞的 基因结构,有调控遗传信息表达的核 苷酸序列.包括启动子和终止子,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,启动子,终止子,2、真核细胞的基因结构,编码区,与RNA聚合酶 结合位点,内含子,外显子,能够编码蛋白质的序列叫做外显子,不能够编码蛋白质的序列叫做内含子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,内含子：,外显子：,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子

6、：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用的核苷酸序列， 包括位于编码区上游的RNA 聚合酶结合位点（启动子）。,非编码序列：,包括非编码区和内含子,3、原核细胞与真核细胞的基因结构比较,思考,编码相同数目氨基酸的蛋白质，原核细胞与真核细胞基因结构一样长吗？,连续,不连续,编码区,非编码,（PCR，polymerase chain reaction ）,PCR扩增仪,多聚酶链式反应, 概念：PCR全称为_，是一项 在生物_复制_的核酸合成技术,条件：_、 _、_ 、 _ 、_. 等,原理：_,方式：以_方式扩增，即_（n为扩增循 环的次数）,结果：,多聚酶链式反应,体外,特定DNA片段,双链DNA复

7、制,四种脱氧核苷酸,一对引物,DNA聚合酶,指数,2n,使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增,要有一段已知目的基因的核苷酸序列（前提条件）,温度,过程：,a、DNA变性（90-95）：双链DNA模板 在热作用下，_断裂，形成_,b、退火（复性55-60）：系统温度降低，引 物与DNA模板结合，形成局部_。,c、延伸（70-75）：在Taq酶的作用下， 合成与模板互补的_。,氢键,单链DNA,双链DNA,DNA链,d、变性、退火、延伸、多次重复,用_切割目的基因，使其产生 。,用一定的 切割质粒，使其出现一个切口，产生_。,(基因工程的核心),将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_

8、，形成了一个重组DNA分子(重组质粒)。,限制酶,黏性末端,同种限制酶,同种黏性末端,切口,DNA连接酶,基因表达载体的构建,（一）构建目的,使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。,（二）构建零件及其作用,目的基因,启动子,基因表达载体的组成,RNA聚合酶识别和结合的一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，RNA聚合酶与之结合才能驱动基因转录出mRNA，进而获得需要的蛋白质。,终止子,标记基因,一段特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，作用是使转录在所需要的地方停止。,鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。,三 将

9、目的基因导入受体细胞,（一）转化：,（二）方法,将目的基因导入 植物细胞,将目的基因导入 动物细胞,将目的基因导入 微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞,目的基因进入_内，并且在 受体细胞内维持_和_的过程,受体细胞,稳定,表达,1、将目的基因导入植物细胞的方法： （1）农杆菌转化法 农杆菌特点：,易感染双子叶植物和裸子植物，对大多数单子叶植物没有感染能力,原理：Ti质粒上的T-DNA可以转移到受体细胞，并整合到受体细胞染色体的DNA上。,过程：,优点： 经济、有效,（2）基因枪法 （3）花粉管通道法,2、将目的基因导入动物细胞 方法：显微注射法 程序：,显

10、微注射法,含目的基因的表达载体,动物的受精卵,含目的基因的受精卵,早期胚胎,雌性动物输卵管或子宫,转基因 动物,为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是受精卵？,3、将目的基因导入微生物细胞 原核生物特点：繁殖快、单细胞、遗传物质少 方法：,用Ca2+处理细胞 感受态细胞 表达载体与感受态细胞混合 感受态细胞吸收DNA分子,四、目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,(检查是否成功),分子水平检测,个体水平鉴定：,检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,DNA分子杂交,DNA分子杂交,抗原

11、-抗体杂交,目的基因的检测与鉴定,1. 检测转基因生物的DNA上是否插入了目的基因,提取受体生 物全部DNA,DNA片段,（表明目的基因已插入）,显出杂交带,提取受体生 物全部DNA,显出杂交带,（表明目的基因已插入）,提取受体生 物全部DNA,显出杂交带,（表明目的基因已插入）,提取受体生 物全部DNA,显出杂交带,2. 检测目的基因是否转录出了mRNA,显出杂交带,（表明目的基因已转录出了mRNA）,检测DNA利用的是DNA与DNA杂交，检测mRNA利用的是DNA与mRNA杂交。,提取受体生物的mRNA,方法:分 子 杂 交,过程:, 方法：抗原抗体杂交,3 检测目的基因是否翻译出蛋白质,

12、提取受体生物的蛋白质,显出杂交带,（表明目的基因已形成蛋白质产品）,（二）、鉴定（个体生物学水平）,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等, 过程：,归纳步骤,归纳: 基因工程的基本操作程序,获取目的基因 从基因文库 利用PCR 化学方法人工合成 构建基因表达载体 目的基因、启动子、终止子、标记基因 将目的基因导入受体细胞 农杆菌转化法、显微注射法 目的基因的检测与鉴定 检测：是否插入、转录、翻译 鉴定：,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。 （1）获得耐盐基因后，构建重组DNA分子所用的限制

13、性内切酶作用于图中的 处，DNA连接酶作用于 处。（填“a”或“b”）,练习1：(2008理综山东卷)为扩大可耕地面积，增加粮食产量，黄河三角洲等盐碱地的开发利用备受关注。我国科学家应用耐盐基因培育出了耐盐水稻新品系。 （2）将重组DNA分子导入水稻受体细胞的常用方法有农杆菌转化法和 法。 （3）由导入目的基因的水稻细胞培养成植株需要利用 技术，该技术的核心是 和 。 （4）为了确定耐盐转基因水稻是否培育成功，既要用放射性同位素标记的 作探针进行分子杂交检测，又要用 方法从个体水平鉴定水稻植株的耐盐性。,答案：（1）a a （2）基因枪法（花粉管通道法） （3）植物组织培养（1分） 脱分化（去

14、分化） 再分化 （4）耐盐基因（目的基因） 一定浓度盐水浇灌（移栽到盐碱地中）,1）以下说法正确的是 （ ） A、所有的限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列 B、质粒是基因工程中唯一的运载体 C、运载体必须具备的条件之一是：具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接 D、基因控制的性状都能在后代表现出来,C,练习,2）不属于质粒被选为基因运载体的理由是 A、能复制 （ ） B、有多个限制酶切点 C、具有标记基因 D、它是环状DNA,D,练习,3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞

15、D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,练习,4）有关基因工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,练习,5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 （ ） A、人工合成目的基因 B、目的基因与运载体结合 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因的检测和表达,C,练习,(四)目的基因的检测与鉴定,检查是否成功,检测,鉴定,检测转基因生物染色体的DNA 上是否插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的

16、基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,方法,方法,方法,DNA分子杂交,分子杂交（注意与上不同之处）,抗原抗体杂交,常用的受体细胞：,动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。,将目的基因导入受体细胞的原理：,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,转化,目的基因进入_内，并且在受体细胞内维持_和_的过程。,受体细胞,稳定,表达,将目的基因导入受体细胞,方法,导入植物细胞,导入动物细胞,导入微生物细胞,农杆菌转化法,基因枪法,花粉管通道法,显微注射法,感受态细胞吸收DNA分子,将目的基因导入受体细胞,(检查是否成功),分子水平检测,个体水平鉴定：,检测转基因生物染色体的DNA上是否

17、插入了目的基因,检测目的基因是否转录出了mRNA,检测目的基因是否翻译成蛋白质,抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等,DNA分子杂交,DNA分子杂交,抗原-抗体杂交,目的基因的检测与鉴定,易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上,农杆菌特点：,农杆菌转化法,2.微生物作受体细胞原因：,将目的基因导入微生物细胞,3.转化方法：,繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,处理细胞 细胞表达载体与感受态细胞混合_细胞吸收DNA分子。,Ca2+,感受态,感受态,1.常用菌：,大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌等。,显微注射法,含目的基因的表达载体,动物的受精卵,含目的基因的受精卵,早期胚胎,雌性动物输卵管或子宫,转基因 动物,为什么将目的基因导入动物细胞常用的受体细胞是受精卵？,该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单链的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光剂