《基因与载体连接》PPT课件.ppt

1、第六章 基因与载体连接,一、黏性末端与平末端的连接 二、其他连接方法,一、黏性末端与平末端的连接,一）黏性末端DNA分子间的连接,DNA连接酶把相互靠近的5端磷酸与3-OH连到一起。,1. 两段DNA的连接,依靠粘性末端,依靠粘性末端,2. DNA片断与载体的连接,nick,ligase,3.,4 . 粘性末端的更换,在DNA片段上某一酶切口处换成另一种酶切口,二) 平末端（blunt end）的连接,5端与3端并列靠近的时间太短，不容易被连接酶连接。,1. 直接连接,T4DNA连接酶虽然能连接平末端，但效率很低，只有粘性末端的1%。,5,5,5,5,3,3,3,3,-OH,-OH,-P,-P

2、,P-,P-,HO-,HO-,5,3,-OH,-P,P-,HO-,5,3,1972年，斯坦福大学的P. Labban和P. Kaiser提出。,（1）同聚物加尾 法,2. 人工加尾形成 “粘性末端”,DNA末端转移酶能在没有模板的情况下给DNA的3-OH端加上脱氧核苷酸。,原理：,分别给载体和插入片断加上互补的核苷酸。,加尾碱基互补,缺点：,优点：,能把任何片段连接起来,不能把插入片段再切下来。,非酶切位点,5突出的末端 外源片段先用Klenow补平；然后用TdT补加polyC；载体片段也用Klenow补平，加polyG，退火不经连接即可转化。目的是：不使酶切位点遭受破坏。,5 3 ,3 5

3、,5 3 ,3 5 ,外源基因,载体,TdT,ployC,TdT,ployG,Klenow补3平端,5 ,5 ,5 ,5 ,CCCCC,CCCCC,GGGGG,GGGGG,退火,用T4 DNA连接酶连到平端DNA上，然后再用酶切，形成一个人工粘性末端。,（2）衔接物(linker)连接, linker,用化学合成法合成的一段10-12bp的特定限制性内切酶识别位点序列的平端双链。,GGAATTCC CCTTAAGG,EcoRI linker：, linker的作用,缺点：,1）可以用内切酶把插入片段切下来。,如果插入片段内部也有该酶位点，不能切下完整的插入片段,2）能给载体连接上Polylin

4、ker:,优点：,（3）DNA接头 (adapter)连接法,1978年康内尔大学的吴瑞教授发明。,5p-GATCCCGG-OH3 GGCC-p 5,BamH I adapter,用T4 DNA连接酶连到DNA分子的两端，直接成为人工粘性末端。, adapter,一头平末端、另一头粘性末端（某种酶切位点序列）。, adapter的作用,Blunt-ended DNA,5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5,BamH I adapter,P-,-P,5p-GATCCCGG- GGCC-,-CCGG -GGCCCTAG-P5,5p-GATCCCGG- GGCC-,CCGG GGCCC

5、TAG-P5,CCGGGATCCCGG-OH GGCCCTAGGGCC-P5,接头自我连接,接头与接头会彼此以粘性末端接在一起，影响与DNA片段的连接。,优点：,连上后就能用。,缺点：,先用小牛肠碱性磷酸酶（CIP）处理接头，水解掉其5端的磷酸，防止自我连接。 （以后再用T4多核苷酸激酶加上磷酸。）,防止自我连接,5p-GATCCCGG-OH HO-GGCC-P,P-CCGG-OH HO-GGCCCTAG-P5,CCGGGATCCCGG-OH HO-GGCCCTAGGGCC5,接头之间不能形成磷酸二酯键的自我连接！,5GATCCCGG-OH HO-GGCC5,5CCGG-OH HO-GGCCC

6、TAG5,CIP处理,-OH,HO-,Blunt-ended DNA,5p-GATCCCGG-OH3 HO-GGCC-p5,BamH I adapter,P-,-P,5GATCCCGG- HO-GGCC,CCGG-OH -GGCCCTAG5,5GATCCCGG-OH3 HO-GGCC5,缺口,缺口,HO-,-OH,CIP处理,T4 ligase,虽然有缺口，但仍然能与DNA片断连接。,一）PCR产物的连接,1. 在引物的5端设计酶切位点,符合载体的多克隆位点(MCS)；,（1）设计原则,避免与所扩增的DNA片断内部酶切位点重复。,二、其他连接方式,（2）带酶切位点的引物结构,3端1520bp与

7、模板互补； 5端610bp是某个内切酶的识别序列。,（5端多余的35bp属保护碱基）,引物1,GCAGAATTC,互补序列,模板,EcoRI位点,5-,-3,GCAGAATTC,互补序列,5-,-3,3,模板,GCAGAATTC,互补序列 PCR产物,5-,-3,3,复性,延伸,模板,模板,3,3,GCTAGCCGG,互补序列,模板,BamH I 位点,-5,3-,5,复性,延伸,模板,模板,3,3,GCTAGCCGG,互补序列,-5,3-,模板,5,GCTAGCCGG,PCR产物 互补序列,-5,3-,引物2,带酶切位点的PCR产物,GCAGAATTC,PCR产物,5-,-3,GCTAGCC

8、GG,PCR产物,-5,3-,CGTCTTAAG,CGATCGGCC,EcoRI位点,BamHI位点,AATTC,PCR产物,5-,-3,GCTAG,PCR产物,-5,3-,G,C,EcoRI,BamHI,两头各有一个粘性末端！,2. 与T载体直接连接,（1）PCR产物两个3端一般都有一个A,Taq DNA聚合酶的特性：在DNA双链的3端再加上一个多余的核苷酸（优先加A）。,（2）T载体的两个3端人为地各加一个T,利用Taq DNA聚合酶，当原料中只有dTTP时，被迫在平端载体上添加T！,A,A,dNTP,T,T,dTTP,Taq DNA聚合酶,载体,PCR产物,TA,TA,二）DNA体外连接

9、应注意的事项,插入片断与载体的酶切位点互补,相同的粘性末端才能有效地连接,尽量避免平端连接,决不能进行非粘性末端连接,（1）用相同的酶切,（2）用同尾酶切,BamH I、Bcl I、Bgl II、Sau3A I、XhoII,都产生GATC4个碱基的粘性末端。,2. DNA插入的方向正确,（1）用双酶切,由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。,EcoR I,BamH I,EcoR I,BamH I,EcoR I,BamH I,3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确,（1）DNA定向插入,（2）起始密码,要注意载体上有ATG起始密码时,ATGGAATTC,载体,ATGCGGAATTCT,插入片断,EcoRI,EcoRI,ATGGAATTC T,重组,但移码突变！,4. 防止载体自身环化连接,（1）提高插入片断的用量,连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。,（2）用碱性磷酸酶处理载体,载体切口的5磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。,5,3,载体,插入片断,三） 载