《生物化学》教学课件：第三章 多聚核苷酸与核酸

1、第 三 章多聚核苷酸与核酸Polynucleotides AND Nucleic Acids,第一节 多聚核苷酸 Polynucleotides,一、多聚核苷酸就是核苷酸的多聚物,多个核苷酸（nucleitide）通过3，5-磷酸二酯键（phosphodiester bond）连接、形成的链状聚合物，即多聚核苷酸（polynucleotides）,（一）3, 5-磷酸二酯键是核酸的基本结构键,一分子的核苷酸的3-位羟基与另一分子核苷酸的5-位磷酸基通过脱水可形成3,5-磷酸二酯键，从而将两分子核苷酸连接起来。,（二）多聚核苷酸链有方向性,（三）书写方法,5 pApCpTpGpCpT-OH 3,

2、5 A C T G C T 3,（四）核酸分为核糖核酸和脱氧核糖核酸脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid, DNA)存在于细胞核和线粒体，携带遗传信息，并通过复制传递给下一代。核糖核酸(ribonucleic acid, RNA)分布于细胞核、细胞质、线粒体。是DNA转录的产物，参与遗传信息的复制与表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体,二、多聚核苷酸链在细胞内通过复制和转录而合成,生物体内的DNA链或RNA链的合成是在包括DNA聚合酶或RNA聚合酶在内的一组酶共同参与下完成的。这个合成过程以dNTP或NTP为原料，以单链DNA链为模板，逐步地完成从5-末端到3-末端的

3、合成。,三、多聚核苷酸链可在体外经多种方式合成,（一）DNA聚合酶链反应是当前获得DNA片段最常用技术（二）单链寡脱氧核糖核苷酸链可利用亚磷酰胺三酯方法合成 （三）核糖核苷酸链可利用体外转录体系合成,四、核苷酸的排列顺序就是多聚核苷酸链的一级结构,多聚核苷酸链的核苷酸从5-末端到3-末端的排列顺序。 由于核苷酸间的差异主要是碱基不同，所以也称为碱基序列。,DNA分子主要由dAMP、dGMP、dCMP和dTMP四种脱氧核糖核苷酸所组成。DNA的一级结构就是指DNA分子中脱氧核糖核苷酸的排列顺序及连接方式。 RNA分子主要由AMP，GMP，CMP，UMP四种核糖核苷酸组成。RNA的一级结构就是指R

4、NA分子中核糖核苷酸的排列顺序及连接方式。,第二节 DNA的结构和功能 Structure and Function of DNA,一、 DNA的二级结构是右手双螺旋,（一）DNA双螺旋结构的研究背景：,夏尔加夫（Chargaff,Erwin) 奥地利-美国生物化学家。 四十年代后期，夏尔加夫是定量确定存在于核酸分子中的各种氮碱的科学家之一。 他采用纸层析法和紫外法仔细分析了DNA的组成成分，对各种核酸分子进行广泛的试验。 发现通常每种核酸分子里腺嘌呤的数目同胸腺嘧啶的数目相等；鸟嘌呤的数目则和胞嘧啶的数目相等。 这一发现对克里克和沃森建立沃森-克里克DNA结构模型是非常有益的 。,19501

5、953，夏尔加夫（Chargaff,Erwin)研究小组对DNA的化学组成进行了研究，发现： DNA碱基组成有物种差异，且物种亲缘关系越远，差异越大； 相同物种，不同组织器官中DNA碱基组成相同，而且不因年龄、环境及营养而改变； DNA分子中四种碱基的摩尔百分比具有一定的规律性，即A=T、G=C、A+G=T+C。这一规律被称为Chargaff原则或叫碱基组成规律。,1951年发现了DNA晶体的X线衍射图谱中存在两种周期性反射，证明DNA是一种螺旋构象。 Watson和Crick综合对DNA的知识，提出DNA双螺旋结构模型,(二) B型双螺旋DNA的结构特点： （1）两条链反向平行，绕同一轴相互

6、缠绕成右手螺旋； （2）磷酸和戊糖交替处于螺旋外围，碱基处于内部，形成碱基对； (3) 双螺旋的直径为2nm， 螺距为3.4nm； 每个螺旋有10.5个碱基对，每两个碱基对间相对旋转角度为36,（4）两条链间存在碱基互补：A与T或G与C配对形成氢键，称为碱基互补原则（A与T为两个氢键，G与C为三个氢键）；一条链的核苷酸序列可以决定另一条互补链的核苷酸序列。 （5）螺旋的稳定因素为： 氢键和碱基堆积力； 两条互补链间碱基对形成氢键，横向稳定。 相邻的两个碱基对在旋转过程中会彼此重叠，产生具有疏水性的碱基堆积力，维持纵向稳定。对双螺旋结构稳定更为重要。,Watson-Crick的DNA双螺旋,B型

7、双螺旋DNA的结构特征,碱基配对及氢键形成,（三）DNA构象有多态性,1 DNA双螺旋分子的钠盐结晶结构一共发现了三种，分别 命名为A、B和C型。 2 其中B型与Watson-Crick提出的模型一致，是在相对湿度92下得到的，这是DNA双螺旋在水性环境和生理条件下最稳定结构。 3 A和C型在降低相对湿度的条件下形成，它们的螺距都比B型要短。沟槽、旋转角度等都有变化。 4 右手螺旋。,Z型DNA首先在富含GC的DNA短片段中发现，后来证明天然DNA中也有。 它是一种左旋螺旋。 在细胞中可能有助解链和调控基因表达的作用。,二、DNA在二级结构基础上形成超螺旋结构,（一）超螺旋结构具有不同的拓扑异

8、构体,DNA在双螺旋结构基础上通过盘绕和折叠所形成的空间构象称为三级结构。,超螺旋结构(superhelix 或supercoil) 将DNA的两端固定，使之旋进过分或旋进不足，DNA双链上就会产生额外的张力而发生扭曲，以抵消张力。 这种扭曲称为DNA双链的超螺旋结构。,松弛态DNA（relaxed DNA） 在溶液中是以能量最低的状态存在的线性DNA 。,负超螺旋(negative supercoil) 自然界中闭合双链DNA，即细胞中的环状DNA，一般呈负超螺旋。 DNA双螺旋为右旋螺旋。由于右旋螺旋不足，导致部分碱基不形成配对。 在拓扑异构酶的作用下，分子通过整体拓扑学上的右旋来补足右旋

9、螺旋的不足。 旋进过分的方向与DNA双链的螺旋方向相反 在数学上呈1：1，即分子整体右旋一圈来补双螺旋上的一圈不足。,自然条件下的DNA都是以负超螺旋的构象存在的，也就是说，DNA的实际螺旋数要少于它含有的碱基对数目应该对应的螺旋数。 负超螺旋状态有利于解开DNA双链。 DNA的复制、转录、组装等许多过程都需要解开双链才能进行。 生物体可以通过DNA的不同超螺旋结构来控制其功能状态。,正超螺旋(positive supercoil) 为双螺旋旋转过度，通过分子整体的左旋来去除过度的螺旋。 正超螺旋旋进过分的方向与DNA双链的螺旋方向相同,（二）原核生物DNA和线粒体DNA是环状DNA的结构,原

10、核生物的DNA都是闭合环状的双螺旋结构。它在细胞内紧密缠绕形成了致密的小体，称为类核（nucleoid）。,线粒体和叶绿体是真核细胞中含有核外遗传物质的细胞器。线粒体DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)是一个封闭的双链环状分子。人mtDNA全长16,569个碱基对，共计37个基因, 分别编码13个蛋白质、2个rRNA、22个tRNA。,核小体(nucleosome)是染色质的基本组成单位，由DNA和蛋白质构成 。双螺旋的DNA分子围绕一蛋白质八聚体进行盘绕，从而形成特殊的串珠状结构，称为核小体。核小体结构属于DNA的三级结构。 完整的核小体由两部分组成： 即核小体核心（n

11、ucleosome core），以及连接各核心颗粒之间的区域称连接区（linker）。,（三）真核生物DNA与组蛋白组成高度有序的染色质,核小体是染色质的基本组成单位，由DNA和5种组蛋白（H1,H2A,H2B,H3,H4）组成。 两分子组蛋白H2A,H2B,H3,H4构成八聚体核心蛋白， 长度150bpDNA缠绕在八聚体上构成核小体核心颗粒。 DNA和H1构成连接区，连成染色质丝，使染色质DNA体积压缩67倍。,染色质纤维进一步压缩成染色单体，在核内组装成染色体。此过程DNA被压缩几千倍,将2米长的DNA组装在核内。 细胞周期大部分时间核DNA以松散的染色质存在，分裂期以致密的染色体存在。,

12、DNA双螺旋 核小体 串珠状多核小体细丝（染色质丝） 中空螺线管（直径30nm) 超螺线管（染色质纤维直径400nm ） 染色单体,三、DNA是生物遗传信息的载体,早在20世纪30年代，人们就已经知道了染色体是遗传物质，也知道了DNA是染色体的组成部分。 直到Avery等人采用细菌转化实验（1944年），后经Hershey和Chase通过同位素标记噬菌体DNA感染细菌实验（1952年）才直接证明了DNA是遗传的物质基础。,（一）DNA是遗传的物质基础,基因（gene）是生物遗传信息的携带者。它是编码一种蛋白质或一条多肽链或一种RNA的DNA的功能片段。它是一个功能性遗传单位，也是一个突变单位或

13、重组单位。,DNA是生物遗传信息的载体，并为基因复制和转录提供了模板。它是生命遗传的物质基础。 DNA具有高度稳定性的特点，用来保持生物体系遗传的相对稳定性。 DNA又表现出高度复杂性的特点，它可以发生各种重组和突变，适应环境的变迁，为自然选择提供机会。,（二）DNA全部核苷酸序列组成基因组 基因组(genome)是指细胞或生物体的一套完整的单倍体遗传物质，是所有染色体上全部基因和基因间的DNA的总和。 基因组是一个十分稳定的体系。 1 同一种系不同个体的染色体数目是相同的。 2 各染色体上有相同数量的基因和基因分布。 3 也有基本相同的核苷酸顺序。 一个有机体从它的发生、发展到衰老、死亡，不

14、同细胞、组织和器官的基因组是基本稳定不变的. 绝大多数生物个体的基因组是DNA； 但有些病毒的基因组是RNA。,第三节 RNA的结构与功能 Structure and Function of RNA,RNA是DNA的转录产物。 RNA通常以单链线性形式存在，但是可以通过链内的碱基互补配对形成局部的双螺旋结构，进而形成三级结构。 与DNA相比，RNA的种类、大小、结构以及稳定性表现出了多样化，这与它们的功能多样化密切相关。,一、信使RNA结构含有氨基酸编码序列,内含子 (intron),* mRNA成熟过程,外显子 (exon),（一）mRNA 5-末端具有帽结构 大多数真核成熟的mRNA分子具

15、有典型的5-端的7-甲基鸟苷三磷酸帽子。 5帽子结构是在核内转录后由鸟苷酸转移酶催化，加上7-甲基鸟苷三磷酸，形成55的连接，不再有末端的5磷酸结构。同时与帽子结构相邻的第一个和第二个核苷酸中戊糖C-2通常也被甲基化，形成帽子结构：m7GpppNm-。,真核mRNA的5-末端7-甲基鸟嘌呤核苷帽状结构及核糖甲基化,帽子结构作用 帽子结构可以与帽结合蛋白(CBP)结合形成复合物： 1) 使mRNA从胞核向胞质转移 2) 与翻译过程相关因子结合 3) 保护mRNA,（二）mRNA 3-末端具有多聚A的尾结构 大多数真核mRNA的3末端是一段有80250个腺苷酸的多聚腺苷酸结构，称为多聚A尾(pol

16、y(A)-tail) 。 多聚A尾在细胞内与poly(A)结合蛋白poly(A)-binding protein, PABP相结合而存在，每1020个腺苷酸结合一个PABP单体。所以，真核细胞的mRNA的3-端实际上是一个poly(A)和蛋白质多聚体形成的复合物。,真核生物mRNA 3-端的polyA结构是在mRNA转录好后由polyA转移酶催化加入的，功能与帽子结构相近。,mRNA核内向胞质的转移 保护mRNA 翻译起始的调控,帽子结构和多聚A尾的功能,（三）mRNA含有氨基酸密码子 mRNA的功能是转录核内编码蛋白质信息的DNA碱基排列顺序，并携带至细胞质，指导蛋白质合成。 mRNA分子从

17、5-末端的第一个AUG(起始密码子)开始，每3个核苷酸为一组，决定肽链上一个氨基酸，称为三联体密码(triplet code)或密码子(codon)。位于起始密码子和终止密码子之间的核苷酸序列称为开放阅读框(open reading frame，ORF)，可读框内的核苷酸序列决定了多肽链的氨基酸序列。,一条完整的mRNA包括5-非编码区、编码区和3-非编码区。 编码区包括起始密码子、编码氨基酸的序列和终止密码子。,二、转运RNA,（一）tRNA的二级结构：,三叶草二级结构模型。 主要特征： 1.四臂三环； 2.氨基酸臂3端有CCAOH的共有结构； 3.D环上有二氢尿嘧啶（D）； 4.反密码环上

18、的反密码子与mRNA相互作用； 5.可变环上的核苷酸数目可以变动； 6.TC环含有T和； 7.含较多修饰碱基。,N,N二甲基鸟嘌呤,N6-异戊烯腺嘌呤,双氢尿嘧啶,4-巯尿嘧啶,稀有碱基,tRNA中常见的稀有碱基,氨基酸臂,可变臂,DHU臂,反密码臂,TC臂,tRNA有识别mRNA密码的反密码子,* tRNA的功能 活化、搬运氨基酸到核糖体，参与蛋白质的翻译。,（二）tRNA的三级结构：,* rRNA的结构,三、核糖体RNA与核糖体蛋白组成核糖体,* rRNA的种类（根据沉降系数）,真核生物 5S rRNA 28S rRNA 5.8S rRNA 18S rRNA,原核生物 5S rRNA 23

19、S rRNA 16S rRNA,（一）原核、真核rRNA分子质量不同,核糖体的组成,rRNA与核糖体蛋白质共同构成核糖体，是蛋白质生物合成的场所：为肽链合成所需要的mRNA、tRNA、多种蛋白因子提供了相互结合的位点和相互作用的空间环境。,（三）rRNA参与组成的核糖体是蛋白质翻译的场所,四、非信使小RNA具有多样性,其他小分子RNA统称：非mRNA小RNA（snmRNAs） snmRNAs包括：核内小RNA（snRNA）、核仁小RNA（snoRNA）、胞质小RNA（scRNA）、催化性小RNA（核酶）、小片段干扰RNA（siRNA）,1 核内小RNA ：snRNA,snRNA主要存于细胞核中

20、，占细胞RNA总量的0.11%，与蛋白质以RNP（核糖核酸蛋白）的形式存在。 由于其分子量较小，约含70300个核苷酸，故称之为核内小RNA( small nuclear RNA，snRNA)。,snRNA至少有15种之多，其中有7种均富含尿苷酸(U)，含量可高达35，故称其为U族snRNA，即U-snRNA。 包括U1、U2、U3、U4、U5、U6及U7-snRNA。 其他则称为非U族snRNA 。 每分子snRNA与78种蛋白质分子结合，以小核糖核蛋白(snRNP)颗粒的形式存在和执行功能。,snRNA的作用： 在hnRNA和rRNA的加工、细胞分裂和分化、构成染色质等方面有重要作用。 现

21、已知，U1、U2、U4、U5、U6 snRNP是mRNA前体加工时必不可少的因素， U7-snRNP参与组蛋白的mRNA3端的成熟过程， U3-snRNP参与rRNA前体的加工。 snRNA既非任何其他RNA的前体，亦非其他RNA代谢的中间产物。而是具有独特功能并且独立存在的实体。,2 小片段干扰RNA（siRNA）,小片段干扰RNA（siRNA） 是宿主对外源侵入的基因所表达的RNA链进行切割，产生的具有特定长度和特定序列的小片段RNA。 这些siRNA与外源侵入的基因所表达的mRNA相结合，通过同源RNARNA相互作用，并诱发这些靶mRNA的降解。 利用这一机制发展起来的RNA干扰技术是研

22、究基因功能的有力工具。,3 核酶,1981年， Thomas Cech 发现RNA的催化活性，提出核酶（ribozyme）。 具有自身催化作用的RNA称为核酶，大部分核酶参加RNA合成后的加工和成熟。 核酶通常具有特殊的分子结构，如锤头结构。,第 四 节 核 酸 的 理 化 性 质 Chemical and Physical Properties of Nucleic Acids,一、核酸的理化性质 （一）核酸一般理化性质 1.为两性电解质，通常表现为酸性。 2.DNA为白色纤维状固体，RNA为白色粉末，不溶于有机溶剂。 3.DNA溶液的粘度极高，而RNA溶液要小得多。 4.RNA能在室温条件

23、下被稀碱水解而DNA对碱稳定。 5.利用核糖和脱氧核糖不同的显色反应鉴定DNA与RNA。,（二）核酸是两性分子,碱基可发生互变异构 碱基在体液环境中以碱性解离为主,（三）核酸溶液具有高分子性质,黏滞度 ： DNA RNA dsDNA ssDNA 沉降系数： 溶液中的核酸在离心力场中可下沉。DNA分子经反复盘曲形成超螺旋后，其沉降系数增加，超螺旋松解后其沉降系数减小。,（四）核酸具有紫外线吸收特性,嘌呤和嘧啶碱基具有共轭双键， 核酸的紫外吸收（OD260） 单核苷酸 ssDNA（或RNA） dsDNA,1. DNA或RNA的定量 A260=1.0相当于 50g/ml双链DNA 40g/ml单链D

24、NA（或RNA） 20g/ml寡核苷酸 2. 判断核酸样品的纯度 DNA纯品: A260/A280 = 1.8 RNA纯品: A260/A280 = 2.0,A260的应用,二、核酸变性、复性,定义：核酸的变性（denaturation）指DNA双螺旋之间的氢键断裂变成单链、或RNA局部氢键断裂变成线性单链结构，从而导致DNA的理化性质及生物学性质发生改变的过程,方法：过量酸，碱，加热，变性试剂如尿素以及某些有机溶剂如乙醇、丙酮等,（一）核酸变性是双链解离为单链的过程,DNA变性后的性质改变： 增色效应：指DNA变性后对260nm紫外光的光吸收度增加的现象。 解链过程，暴露的碱基不断增加。 旋

25、光性下降。 粘度降低。 生物学功能丧失或改变。,DNA变性的本质是双链间氢键的断裂,（二）核酸变性时伴有增色效应,DNA的紫外吸收光谱,增色效应：DNA变性时其溶液A260增高的现象。,热变性,解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260值作图，所得的曲线称为解链曲线（融解曲线）。,Tm： DNA变性是个突变过程，变性是在一个相当窄的温度范围内完成，类似结晶的熔解。将260nm紫外吸收的增加量达到最大增量一半时所对应的温度称融解温度(melting temperature, Tm)或叫解链温度。 影响因素： 1DNA均一性决定融解温度范围大小； 2G-C碱基对含量决定融解温度高低；

26、3介质中的离子强度影响变性。,Tm值是DNA变性的重要参数,（三）变性的DNA可以复性,DNA复性(renaturation)的定义 当变性条件缓慢地除去后，两条解离的互补单链可重新配对结合成为双螺旋结构，或恢复局部双螺旋结构。这一现象称为复性。,减色效应 DNA复性时，其溶液A260降低。,热变性的DNA经缓慢冷却后才可复性，这一过程称为退火(annealing) 。,（四）利用变性、复性可进行分子杂交,将不同来源的DNA混合在一起，经热变性后，让其慢慢冷却复性。若这些异源DNA之间在某些区域具有互补的序列，复性时就会形成杂化双链（heteroduplex）。 这种杂化双链可以在不同的DNA

27、单链之间形成，也可在RNA单链之间形成，甚至还可以在DNA单链和RNA单链之间形成，其前提条件是两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系。这种现象称为核酸分子杂交（hybridization）。,DNA-DNA 杂交双链分子,不同来源的DNA分子,核酸分子杂交的应用 （1）Southern印迹可检测DNA （2）Northern印迹用于检测RNA,此外，斑点印迹杂交(Dot blot)和DNA芯片(DNA micray)技术也是利用核酸杂交原理设计的。,三、核酸的化学修饰,核酸化学修饰（chemical modification）可发生在碱基、戊糖，甚至磷酸基。构成tRNA的稀有碱基就是化学修饰的结果。最常见的碱基化学修饰是甲基化（methylation）。 1 保护作用，提高核酸遗传稳定性。 2 与基因