极性物质分离、高含水流动相和相塌陷等问题

1、极性物质分离、高含水流动相和相塌陷等问题反相色谱是迄今应用最广泛的HPLC分离模式，通过熟练控制流动相，譬如改变有机溶剂种类、溶剂组成和pH值，添加表面活性剂、手性试剂和离子对试剂，或者调节流速和温度等操作条件，广大色谱工作者单用C18固定相就成功实现了许许多多的色谱分离。一连串的成功冲昏了头脑，色友们一度认为他们只需要仅仅几种固定相，凭借控制上面这些数量众多的神奇参数，就可以打遍天下无敌手，解决所有碰到的色谱分离问题。抱着这种想法，碰壁是无疑的，他们也有了无论怎么调节参数都束手无策的时候，既不能找到必要的选择性，也不容易获得良好且有重现性的分离。后来，新的固定相和新的表面修饰和键合方法每年就

2、有不断推出。为解决PH4-8时分析碱性化合物的拖尾问题，二十多年前，在低纯度的A型硅胶基质上，推出过一系列碱去活表面处理方法（BDS）做出的固定相；以后进一步推出了目前普遍使用的以高纯度的B型硅胶为基础的各类固定相。又后来,为解决高pH（10）和低pH（2）条件使用时固定相和色谱柱的稳定问题,也推出了一些新固定相和填料表面修饰处理新工艺,如SB固定相、双齿键合、杂化和聚合物包覆等等。 言归正传，对于极性非常强的化合物，面临的是不同的问题。因为溶解度的因素，许多极性化合物更适宜用高含水的流动相，而且只能在有机相浓度极小的情况下有保留能力，有时有机相必须小于5%。随之而来就产生了相塌陷的问题，以及

3、找寻解决这个问题的固定相改进方法，以实现用高含水流动相，甚至是100%水流动相，成功分离高极性化合物的目标。下面将详细介绍有关相塌陷的现象、其对色谱性能的影响、形成原因和机理、避免和修复处理方法以及从根本上消除这种影响的产品层面（固定相改进）的解决方案。一、相塌陷的经典解释反相色谱中固定相通常疏水性都很强,特别是长链烷烃高密度键合的情况下,疏水性更强。在高含水量的流动相环境下，固定相的疏水长碳链倾向于通过互相结合的方式尽量降低表面自由能，固定相的互相结合的结果使填料多孔结构的表面“失湿”，也就是不能很好被流动相润湿了。这个时候，在流动相中的极性待分析物就很难通过吸附扩散等作用接近固定相表面而发

4、生相互作用，色谱保留能力就没有了，就是发生“相塌陷”了,也有人称之为“链折叠”或“固定相倒伏”。图一所示：（a）是在甲醇水流动相下的碳链形状；（b）是100%水 图一流动相下的碳链形状。相塌陷会造成保留时间减少、保留时间没有重现性、拖尾程度增加以及梯度再生恢复时间变长等色谱性能变坏的问题。很多因素会影响保留时间减少的速率和程度，包括键合烷基链的类型、键合密度和硅胶孔径。当固定相的键合密度比较低的时候（小于3umol/m2），相塌陷不是个问题，因为残留在硅胶表面的硅醇基能使填料表面被水分子润湿，使烷基链有机会和极性待分析物中的疏水部位发生作用。当键合相是C3之类的短链烷基时，相塌陷也极少发生，因

5、为烷基链的体积小，对亲水性的硅醇基的屏蔽作用不明显。二、两个研究实例Kazakevichi，LoBrutto等人系统地研究过不同的烷基链固定相的塌陷问题，他们的研究结论是：如果不考虑有机相的存在比例，烷基链处于塌陷状态是最稳定的。流动相中的各组分在固定相中聚积量实际上和烷基链的长度无关。他们观察到，当用100%水流动相低流速冲洗烷基链反相色谱柱过夜后，用尿嘧啶等出峰实际测得的死体积要低于原先预估的死体积。这归因于水的表面张力大，100%水流动相不能进入硅胶内部的小孔所致。用高含量乙腈流动相冲洗至少3小时后，原先的死体积又可以恢复。按照LapLace-Young方程，P=4COS/d（这里的P是

6、流动相进入小孔需要的压力, 是表面张力, 是流动相和填料表面的接触角,d是孔的有效直径），液体表面张力越大，液体和固体表面亲水疏水性质相差越大（接触角大），小孔的有效孔径越小，流动相进入孔内部的难度就越大。Przybyciel和Santangelo用阿莫西林（一种抗生素，极性物质）做了试验，结果见图二。所用色谱柱为C8柱，初期用水乙腈流动相冲洗直至基线稳定，然后转换到0.1%的醋酸流动相（不含任何有机相），（a）图显示阿莫西林保留时间是8.6分钟；关掉泵让仪器休息10分钟，用同样的流动相并重新进样，（b）图显示保留时间只有3.5分钟了，而且峰形也变得很差。三、如何使已经产生相塌陷柱子的色谱性能

7、得到恢复?有一点需要首先强调，相塌陷并没有根本上毁坏色谱柱，是很容易恢复的。还是从LapLace-Young方程(P=4COS/d),我们就可以自然地想到恢复相塌陷柱子性能的方案。一个是系统提供足够大的P,强力将高含水流动相或100%水流动相压入硅胶的小孔内,使流动相润湿小孔,使待测物分子有机会和小孔内的疏水烷基链发生保留作用，图（c）就是Przybyciel和Santangelo对柱子加压270bar，持续10分钟后进样的恢复结果，阿莫西林的保留时间恢复到了7.8分钟，可能加压还不够大的原因，没有完全恢复到原来8.6分的保留水平；另外一个方案就是用COS值小的流动相替换高含水流动相,进入孔内

8、对烷基固定相进行再溶剂化和重新润湿，从而恢复色谱保留能力。他们用60：40的乙腈水以1ml/min的流速冲洗已经相塌陷的C8色谱柱30分钟，然后用0.1%的醋酸流动相测定阿莫西林，图（d）显示保留能力已完全恢复到原来水平，说明水有机混合流动相表面张力低，很容易在正常仪器操作压力条件下，进入小孔润湿C8烷基链。不过，0.1%醋酸流动相如果持续流过已经恢复正常保留能力的色谱柱，随着填料小孔内残留乙腈的不断减少，相塌陷现象又会重现，保留时间又会慢慢下降。（e）图则是两位研究者用专门设计在高含水流动相条件下应用的色谱柱做的对比图谱，保留时间7.5min，阿莫西林峰形也非常漂亮。特别的地方是，这种柱子可

9、以在100%水流动相，在正常的操作压力下，不会发生相塌陷，能保持保留能力的稳定。四、解决高含水流动相下极性物质的保留问题，固定相设计的几种方案1.选用短链烷基键合相且不对硅醇基封尾2.选用亲水性和极性很强的封尾试剂封尾3.对烷基链固定相进行极性基团嵌入的改造4.选用链长更长的烷基固定相5.选用大孔硅胶下面将详细介绍这几种产品层面的解决方案。1.选用短链烷基键合相且不对硅醇基封尾硅胶表面残留硅醇基对色谱性能的不利影响已经是众所皆知,pH5以上硅醇基离子化,离子交换作用的存在可导致碱性化合物的峰形严重拖尾。但任何事情都有正反两面，这里要着重说一下硅醇基存在的正面作用。残留硅醇基赋予了反相填料表面一

10、定程度的极性，当仅凭烷基链不能提供足够的色谱分离选择性时，硅醇基和分析物极性部位的极性相互作用导致的混合作用机制可以改善色谱分离的效果。不过，若非严格保持键合相和残留硅醇基的比例每次一样，批与批之间的重现性很难控制。Kasakevich等人的研究表明：C链小于4个的短链烷基相发生相塌陷的可能性很小，这种情况下起主导作用的分离机制是分析物吸附到烷基链上（而不是扩散）以及分析物和硅醇基的极性相互作用。2.选用亲水性和极性很强的封尾试剂封尾短链烷基相毕竟应用局限性很大，大部分情况还是会用到C4以上的烷基键合相，此时封尾试剂和工艺的选择就很重要。选择合适的极性或亲水性的封尾试剂，可以使填料表面容易被水

11、润湿，充分发挥长链烷基键合相的和分析物的保留作用能力。市场上销售的采用这种工艺的商品色谱柱很多，如热电的Aquasil C18，Alltech的Alltima AQ-C18，YMC的Hydrosphere C18，Waters的Polaris dC18等等。月旭公司的极限系列产品中，Ultimate AQ-C18也属于此类。各个厂家具体使用什么类型的极性封尾试剂和何种键合工艺，属于商业秘密，很少有资料提及，但普遍认为这些封尾试剂的封尾作用方式和传统的封尾试剂如三甲基氯硅烷类似。3.对烷基链进行极性基团嵌入的改造就是先将烷基相进行极性基团嵌入的改造后，再键合到硅胶表面上。改造的部位应该是烷基相接

12、近硅胶表面的碳原子处。极性基团的嵌入，使烷基相在流动相中有机相比例极低时（甚至100%水流动相时）也能被水溶剂化润湿，不会发生相塌陷现象。另外极性基团嵌入在硅胶表面不远的地方，对硅醇基的屏蔽作用也十分有效，不易造成峰形拖尾。所以这种工艺只需一部工艺，将预先嵌入极性基团的烷基链键合到硅胶表面即可，省略了一般有的第二步封尾工序。因为封尾基团容易在酸性条件下水解脱落，这种无封尾工艺生产的填料就有了耐酸的特性，可以在低pH条件下使用。尿嘧啶因为不在大多数反相柱上有保留，通常用作死体积的标定试剂。但在乙醚基嵌入的烷基固定相或者极性基团封尾过的填料，在100%水流动相条件下，尿嘧啶是有保留的，出峰时间甚至

13、在5-氟胞嘧啶和胞嘧啶之后(见图三)。嘌啉和嘧啶等碱性物质、小分子有机酸、儿茶酚胺以及水溶性维生素的测定常常需要用高含水流动相。市场上采用极性基团嵌入工艺的产品有：Supelco的Discovery amide C16，EKA的Kromasil Amide C8，Waters的Symmetry Shield RP18，Agilent的Zorbax Bonus-RP等。最早的报道是日本的野村成功将酰氨嵌入烷基链，具体过程见图四。发展到今天市场上采用极性基团嵌入工艺的产品已经有很多，包括：Supelco的Discovery amide C16，EKA的Kromasil Amide C8，Water

14、s的Symmetry Shield RP18，Agilent的Zorbax Bonus-RP以及Supelco的ABZ等,嵌入烷基链的极性基团包括醚基、氨基、酰基、脲基和酰胺基等不同，月旭公司也将会在不久后推出自己独有的极性基嵌入工艺的纯水柱产品。烷基链嵌入极性基团的纯水柱和用极性基团封尾的纯水柱相比，有如下特点或者应用上的差异：1).尽管嵌入了极性基团,但固定相仍然保持反相特性2).与普通AQ纯水柱的纯粹烷基固定相比较,因为嵌入了极性基团,选择性会有不同,特别是在测定极性物质时。3).硅醇基活性被极性基屏蔽,不易拖尾,峰形更佳。4).因为没有进行过封尾工艺,酸性条件下应用更稳定用一个应用实例

15、来说明极性基团嵌入后选择性的不同,对一些极性物质测定选择性方面有了很大改善.对七种三嗪类农药的分离,(a)是用极性基团嵌入的烷基固定相测定的谱图,分离度极良好,峰形也十分对称。而（b）是用普通烷基固定相测得的谱图，选择性很差，没有分开。4.选用比C18链还要更长的烷基链做固定相前面讨论过有些极性强的物质，即便在有机相比例小于5%的流动相下，在C18柱上也没有分离所需要的足够保留。通过增强固定相的疏水性来增加保留能力，对极性物质来说，也是有效的，因为即便是极性物质也存在一定的疏水部位，极性物质的疏水部位可以和固定相发生疏水相互作用而产生保留。所以，C27到C30的烷基作固定相，比普通高密键合的C

16、18固定相和极性基团嵌入的C18固定相，无论分析非极性和极性物质，一般其保留能力都更强，而且p H稳定性也好很多。意想不到的是，超长链烷基固定相在高水流动相下，抗相塌陷的能力也比C18固定相强，这与固定相的形态随温度的变化有关。C18链上起主要作用的C18H38基团的熔点是29-30摄氏度，而C30H62的熔点是68-69摄氏度。C30链在普通液相的30-40度操作温度下呈固态，因而不容易在高水流动相下发生移动和相塌陷。C18链处于液态状态，这种情况下易移动和发生相塌陷。上面是假设固定相类似处于液态烃的状态，但固态的核磁共振对C30固定相测试的结果表明：随着温度的增加，C30链的可移动性也会增

17、加，会增加纽结和弯曲的程度。图六是用C30柱在100%水缓冲盐流动相测定各类核苷酸的图谱，各个峰形非常的对称，并长时间稳定不发生保留能力逐步损失的现象；而用C18柱在同样情况下测定，35个小时后保留能力就完全丧失了。5.选用孔径更大的硅胶做填料基质孔径变大，按照LapLace-Young方程P=4COS/d，d变大，P就相应变小，高水流动相进入孔内所需要的压力就小了，再加上键合相键合得不那么致密，就不容易发生相塌陷现象。但是孔径大了，硅胶的比表面积就小了，保留能力就要大打折扣了。所以这种方法用得不多。五、增强极性和强极性物质保留能力的几种方法在使用反相色谱分析某些极性物质时,如果出峰时间接近死

18、时间t0,没有保留或保留极小,要取得色谱分析和分离的结果,就需要调整或建立新的色谱方法以解决这种极性分析物的保留能力过弱问题。下面是解决这个问题的一般考虑方法和步骤：1调节流动相pH有一个普遍采用的初步探查合适色谱条件的方法：走一下梯度。譬如在一根4.6x150mm，5um，C18或者C8色谱柱上试着运行20分钟的乙腈水比例变化5-100%的梯度。但这仅对非极性的分析物适合，对酸性和碱性分析物，为了取得重现性好的结果，还必须在水相中加缓冲盐。极性物质很少是中性的，大多数药物分子均属于极性物质，易于离子化。所以建立一种极性物质的色谱分析条件，最好先走水相是低pH的梯度探查方法。低pH条件可以抑制

19、酸性物质的电离，使分析物处于中性状态更容易在反相色谱中得到保留。一般选用0.1%的三氟醋酸或者0.1%的甲酸溶液替代纯水做梯度就可以。另外一个方案是用10-20mM的磷酸盐调节pH到2.5。如果这样调节到低pH就已经取得了合适的保留，下一步就只需要优化流动相中水相的比例就可以取得满意的结果。又如果低pH条件不奏效，分析物就可能是处于碱性状态。对于碱性物质，有效抑制离子化的办法是使流动相的pH大于碱性物质pKa2个单位。对有些物质，就要求流动相的pH就要大于9，甚至要11以上。一般的硅胶色谱柱不能承受，就需要选用像月旭公司的Xtimate超限柱这样的耐高pH的色谱柱进行方法开发。高pH下。一般选用甘氨酸盐等有机缓冲盐比较合适，磷酸盐在碱性条件下对硅胶基体的损害相对较大。幸运的话，通过调节pH至合适的酸度或碱度，你就能找到合适的色谱方法来保留强极性物质。如果还不能如愿，就需要另辟蹊径了。2.选用一款保留能力更强的色谱柱一般载碳量越大，保留能力越强。在反相色谱条件下，即使对极性物质，一般总是C18的保留能力比C8强；不同品牌的色谱柱，虽然同样是C18固定相，但由于硅胶表面键合密度不同，载碳量会有很大的差别。3.离子对试剂当你用100%的水或缓冲盐流动相,在耐水、耐碱或耐酸的保留能力已经很强的柱子上仍得不到足够的保留时，离