1直接反映基因特征,非推测-powerpointpre.ppt

1、DNA遗传标记,特点：1.直接反映基因特征，非推测。 2.基因座位数量多，无论表达与否。 3.多态性程度高，等位基因多，鉴别能力 4.适合于陈旧的样品，检测能力强。 5.灵敏度高，有利于微量样品的检测。 6.易于检测手段的自动化、标准化，重复 性好。逐渐取代了蛋白质水平的检测方,第一部 DNA基础,一、DNA结构与特征 1.DNA分子结构 线性大分子-基本单位为脱氧核苷酸 组成-碱基、脱氧核糖、磷酸 差别-碱基：嘌呤碱腺嘌呤（A）与鸟嘌呤（G） 嘧啶碱胞嘧啶（C）与胸腺嘧啶（T） 结构：碱基+脱氧核糖=脱氧核苷-+磷酸=脱氧核苷酸,2. DNA理化性质 1）DNA的变性 变性（denatura

2、tion）:在一定条件下，DNA双链间氢键断 裂，形成单链结构的过程。也称退火（annealing）。 条件：A：温度上升-Tm值(melting temperature) 50%DNA分子解链的温度。 与GC/TA比值有关。1%GC-0.4。 B：碱性升高- 0.5N NaOH-完全解链。 2） DNA的复性 复性（renaturation）撤除变性条件后，变性的单链 DNA根据碱基互补的原则，恢复成DNA双链的过程。 条件：A：温度降低过低易错配。过高不易复性。 B：高离子强度。 3） DNA分子杂交 杂交（hybridization）：来源不同的两条DNA单链根据 碱基互补的原则，形成双

3、链杂种DNA的过程。,二、基因 1. 基因与基因组 基因（gene）：合成有功能的蛋白质多肽链 或RNA所需的全部核苷酸序列 基因组（genome）：一个生物体的所有基因。 核基因组：细胞核中23对染色体包含的所有基因 线粒体基因组：线粒体DNA中的所有基因 2. 基因结构 结构基因：能够编码产生蛋白质产物的基因。 外显子（exon）：编码序列。 内含子(intron)：非编码序列（间隔列）。 如珠蛋白-1700碱基（bp），编码146个氨 基酸，3个外显子，2个内含子。,3. 基因突变 突变（mutation）：DNA分子中的核苷酸序列的改变。 1）点突变（point mutation）：单

4、碱基置换。 同义突变（same sense mutation）: 简并密码，无突变效应。 错义突变(missense mutation)：新密码子，氨基酸序列变化，产生突变效应。 无义突变(non- sense mutation)：变成终止密码，合成不完整多肽产生突变效应。 终止密码突变（terminator codon mutation)：合成过长的多肽，产生突变效应。 移码突变（frame-shift mutation)：DNA链中插入1个或几个单碱对，使突变处以下部位密码发生变化，使合成的氨基酸种类或序列变化，产生突变效应。 2）片段突变：DNA链中小片段单碱序列发生缺失、重复或 重排，

5、产生突变效应。,单碱基突变(图中用黑点示意位置为突变点),三、DNA多态性的分类 1）长度多态性：等位基因片段长度的个体差 别。由一特定序列，首尾相连串联 重复次数不同产生的个体差别。 可变数目串联重复（variable number of tandem repeat,VNTR） 短串联重复(short tandem repeat,STR) A：产生原因：DNA滑动与同源染色体 不等交换。,B：差别： VNTR STR 重复序列组成 2-7 bp 7-数十bp 重复序列数目 2-10数个 10数个-数百个 鉴别能力 高 极高 优势扩增现象 不明显 极明显 检测灵敏度 极高 稍差 片段总长度 2

6、00-500 bp 数千以上bp C：STR的命名： 非编码区-D3S1358 D3 第三号染色体 S 单拷贝（single copy） 1358 VNTR序列的发现序号 编码区内含子-HumHPRTB 次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因 （ hypoxanthine phosphoribosyl transferase）,1）序列多态性：DNA片段碱基排列顺序的个体差别。 单核苷酸多态性 （single ucleotidepolymorphism,SNPs） 原因：碱基的置换、插入、缺失。 特点：多位于非编码区，选择压力。 数量多，1/1000 bp，300万 二态性，2个等位基因，多态性 程度较低

7、。 孤立事件，人类遗传学意义大。,第二部分 DNA的制备,核心与关键 脑肺肌肉肾 6pg/细胞 一、 理想DNA样品的要求 1. 纯度-RNA、蛋白质、多糖、脂类。 2. 完整性-DNA大分子。 3. DNA量。g/指纹图；ng/PCR；pg/PCR 二、 经典DNA提取法 1. 在弱碱和螯合剂的条件下行组织匀浆， 溶解胞、核膜。 2. 去垢剂与蛋白酶消化蛋白，分离DNA。 3. 有机溶剂去除蛋白，萃取DNA。 4. 乙醇与盐类沉淀DNA。,三、 试剂的使用原理 1.弱碱和螯合剂：Tris-HCl pH8.0，DNA分子稳定。 EDTA（乙二胺四乙酸）-抑制核酸酶。通过螯 合镁离子。 2.去垢

8、剂与蛋白酶：SDS（十二烷基磺酸钠）：增加膜 通透性；促进DNA与蛋白质分解；促使核酸酶 与蛋白质变性。 蛋白酶K：酶解组蛋白。 3.有机溶剂：酚-变性沉淀蛋白质，组蛋白、蛋白酶等。 PH6.0，需Tris-HCl pH8.0平衡。 氯仿-变性沉淀蛋白质，除酚，水相分离。 异戊醇-除酚，除泡沫。 4. 乙醇与盐类：DNA不溶于乙醇与盐类。,四、 基本步骤 1.样品处理-分离细胞，低渗盐水或细胞悬浮液。 10mmol/L Tris-HClpH8.0,0.1mol/LEDTA,20mg/ml胰 RNA酶,0.5%SDS. 2.消化-TNE （15mmol/L Tris-HClpH8.0,15mmo

9、l/LEDTA, 5mmol/L NaCl）4ml，10%SDS0.45 ml，10mg/ml蛋白 酶K（终浓度100g/ml）混匀，503h，45过夜。 3.DNA提取-等体积饱和酚-等体积饱和酚/氯仿/异戊醇（25/24/1）-氯仿/异戊醇（24/1）。500r/min,10min. 4. 沉淀DNA-1/10体积3mol/L NaAc，2倍无水乙醇-70%乙醇。室温挥干。 5. 溶解DNA-适量TE（10mmol/L Tris- HClpH8.0,1mmol/LEDTA,长时间。,五、其他方法 1.Chelex-100提取DNA 基本成分：含有亚氨基二乙酸盐离子的苯乙烯-二乙基 苯共聚物

10、。 基本方法：沉淀细胞；5%试剂200l；560.5h以 上；1008min；剧烈震荡；离心上清。 注意： 离心彻底。 2.硅珠法提取DNA 基本成分：GuSCN（硫氰酸胍，蛋白变性剂）与二氧化 硅（硅珠，核酸吸附剂）。 基本方法：血液（1-4l）TES（100l）SDS （20l）煮沸5min；300lGuSCN溶液 与20l硅珠液保温15 min；离心；离心 加GuSCN溶液；离心加乙醇漂洗； TES5610 min离心取上清。 3.直接煮沸法，10010min,六.注意事项 1.如消化不完全，可用TNE溶解后再重提。 2.消化时间宜长不宜短。 3.操作轻柔。 4.混匀要充分。 5. 挥干

11、不宜过度。,七.不同生物性检材的DNA制备 1.混合斑二步提取法（精液与阴道液） 原理： 精子细胞膜富含硫醇蛋白，包裹DNA 的鱼精蛋白富含半光氨酸，二硫键丰富，可 抵抗蛋白酶作用。二硫苏糖醇（DTT）可还 原二硫键，使蛋白酶发生作用。 方法: (1)分离细胞成分。 (2)常规消化。 (3)加10%SDS40l，1mol/L DTT16l ， 10g/l蛋白酶K4l，37过夜。 (4)常规处理。,八.DNA定量 1.凝胶电泳半定量分析法 标准参照分析。 2.分光光度计分析 原理：核酸于260nm波长为吸收峰，1OD值 为50g/l双链核酸（40g/l单链核 酸），根据OD值可计算DNA含量。蛋

12、白 于280nm波长为吸收峰，260/280比检测 核酸纯度。1.6-1.8 九.DNA纯化,第三部分 聚合酶链式反应技术,聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction，PCR）在模板DNA和4种脱氧核苷酸存在的条件下，由一对特异性引物限定的靶DNA片段，经DNA聚合酶催化的体外合成过程。,一、 PCR的基本过程 1.变性（denaturation）:在加热的条件下（94左右），模板DNA配对碱基间氢键断裂，DNA双链变成单链。 2.退火（annealing）：在降温的条件下（55-62），引物与其互补的模板DNA结合形成杂交双链。 3.延伸（extension）：在合

13、适的温度下（68-72），经DNA聚合酶催化4种脱氧核苷酸，由引物的3端为起始点，从5向3端延伸，合成新的与模板DNA 互补的DNA链。 每反应一个循环，靶DNA片段数量增加一倍，并以指数的量堆积，经30余次循环，产物量可达到2105-7个拷贝。几个循环后扩增产物作为模板。,二、PCR反应的体系 标准体系为50-100l，常用20l。 DNA模板/DNA聚合酶/一对引物/4种脱氧核苷酸/缓冲液。 反应条件：954-5min,9430s,55-6230s,7230-60s,30循环后725-10min。,三、试剂的要求： 1.引物：人工合成的单链DNA。 A：长度15-30bp。Ln=2(G+C

14、)+(A+T)38,延伸温度大。 B：内部的互补序列。 C：引物间的互补序列。 D：序列的随机。 E：识别序列的单拷贝。引物决定特异性。 F：浓度：02-1mol/L。 G：应纯化低温保存。 2. DNA模板 A：量10ng左右。 B：纯，无污染。 3.DNA聚合酶 A：根据具体实验要求选择。 B：注意外切酶活性，5-3或3-5。 C：活性最适温度70-75，半衰期一般9540 min 92130 min D：镁离子依赖。,第六章 DNA多态性分型方法,一、长度多态性分型 扩增片段长度多态性分析（amplified fragment length polymorphisms,Amp-RLP）。

15、主要指VNTR和STR,1.步骤 （1）PCR扩增，遗传标记特异性由特异性引物决定。 （2）电泳分离PCR产物 A：凝胶：聚丙烯酰氨凝（polyacrylamidegel,PAG）， 成分：丙烯酰氨与甲叉丙烯酰氨 凝胶浓度（T）：6-8%，与分析的片段大小有关。 交联度（C）：3%，甲叉/丙烯酰氨与甲叉 B:载样缓冲液：甘油（蔗糖）密度重力，防扩散。 泳速指示剂：溴酚蓝（5%，65bp） 二甲苯青（5%，260bp） C：电压：100-200V,（3）谱带显示： A：溴乙啶染色：ethidium bromide,EB,嵌合与 DNA双链间，紫外线激发红色荧光。 注意：强致变剂。可加凝胶中或后染

16、色。 B：银染色：AgNO3，Ag+可与DNA稳定结合， 甲醛还原Ag+颗粒，显黑褐色。比溴乙啶敏感度高。 C：荧光显色: (P78)染料标记在引物5端，激光激发。 （4）基因型判定：根据等位基因分型标准物（allele ladder）或片段长度标准物(molecular marker)同步 电泳比对判型。 等位基因命名根据重复序列的重复次数。 注意事项：出现3条谱带或3个峰时，污染、混合样品、变异。,2.STR基因座的选择： A：重复序列为4个碱基。 B：等位基因数量在10个左右。 C：基因座距离足够远。 D：引物识别序列尽可能单拷贝。 E：PCR产物在100bp-300bp之间。 3.多基

17、因座复合扩增检测,二、序列多态性分型 （一）限制性片段长度多态性分析法 restriction fragment length polymorphisms,RFLPs 因DNA核苷酸序列的变异，使DNA限制性内切酶识别部位产生、消失或移位，致使酶切片段长度和/或数量发生变化而呈现的DNA多态性。,1. 限制性片段长度多态性的DNA基础 （1） 识别部位的点突变：碱基的替换、修 饰（甲基化）或插入与缺失。 （2） 识别部位间的片段插入与缺失。 （3）识别部位间的重复序列数目的变化。,2. DNA限制性内切酶 restriction endonuclease 能够识别特定的DNA序列，与DNA分子

18、结合后在特定部位将DNA双链切断的核酸水解酶。 （1）生物学功能：水解核酸的磷酸二酯键。 （2）命名：根据微生物的种（第一个字母大 写）、属（前二个字母小写）、变种第一个 字母大写）、发现分离的顺序（罗马数字）。 （3）分类： A：型：远离识别部位随即切割，非特异。 B：型：在识别部位内部切割，特异。 C：型：在识别部位后定点切割，特异。 单位：1U：在标准条件下，1h完全水解1g噬菌体的酶量。,型DNA限制性内切酶： A：识别核酸序列数目4-6个。 B：识别序列为回纹序列。 C：切割后产生的末端分为粘行末端与平 末端。 例：Pst 5-CTGCAG-3 3-GACGTC-5 Hae 5-GG

19、CC-3 3-CCGG-5,3.分型法： 酶+缓冲液+样品-一定的温度-电泳检测。 4.注意事项： A：星号活力。 B：消化时间宜长不宜段。 C：阳性可肯定序列，阴性序列不定。,（二）等位基因特异性寡核苷酸探针杂交分析法 allele specific oligonucleotide,ASO 根据硷基互补的原则,制备识别特定寡核苷酸序列的单链DNA探针,并标记示踪物,在高强度条件下与变性DNA样品杂交,检测示踪物,阳性者为检出相应的等位基因。,1. 相关概念： A：杂交：两条异源寡核苷酸单链按照硷基互补的原则复性为双链的过程。 B：探针：标记有示踪物，能够识别靶核苷酸序列并与之退火杂交的具有以

20、知序列的寡核苷酸单链。 2. 探针的条件: A:长度为20bp左右。 B：具备高度特异性。 C：容易标记示踪物。 D：在杂交过程中本身性质稳定。,3.对示踪物的要求 A:高灵敏度。 B:不影响探针的特异性。 C: 不影响探针的杂交特性。 D：不改变本身的特性。 E：检测方法特异。 F：安全可靠无公害。 G：检测方法简单，重复性好。,4. 示踪物的种类 A：放射性同位素-灵敏度高，有放射性污染。 B：非放射性同位素：半抗原 生物素 荧光物质 酶常见辣根过氧花物酶 碱性磷酸酶 5.检测方法斑点印迹杂交dot blot hybridization 反向斑点杂交reverse dot blot,6.基

21、本操作过程 A：固相滤膜印迹-打点、Southern转移、 真空转移、电转移。常用尼龙膜。 B：DNA变性碱变性、紫外线照射、真 空烘烤。 C：预杂交封闭 D：杂交： 高强度杂交-温度高，离子强度低。 特异不利于复性。 低强度杂交-温度低，离子强度高。 利于复性不特异。 E：漂洗 F：示踪物显示。,三、等位基因特异性PCR（序列特异性引物PCR） allele specific PCR，ASPCR（sequence specific primers,SSP-PCR） 基本原理：根据待测等位基因的碱基差异设计3条特异性引物，其中2条引物为上游（或下游）引物，其3端第1个碱基（或第2、3个碱基）分

22、别与等位基因特异性碱基互补，作为等位基因特异性引物；1条下游（或上游）引物作为共通引物。分为两个体系同时PCR扩增，对比电泳，依据PCR产物的有无判定等位基因的型别，有PCR产物者为阳性，证实该等位基因存在。,方法：1. 设计3条引物，2条等位基因特异性引物，其5端长度有差异（5端差4-6bp），与共通引物引物在1个体系中同时PCR扩增，电泳后，依据PCR产物片段的有无与谱带的位置判定等位基因的型别。 2. 同一片段多等位基因同时检测：依据片段上等位基因数目，设计两组多条等位基因特异性引物，分别与共通引物在1个体系中同时PCR扩增，对比电泳后，依据PCR产物片段的有无与谱带的位置判定等位基因的

23、型别。 3. 不同染色体上多等位基因同时检测：设计两组多条等位基因特异性引物及相应的共通引物，并在引物的5端人工设计10bp左右碱基序列，PCR产物对比电泳后，依据PCR产物片段的有无与谱带的位置判定等位基因的型别。 技术关键点：1.引物特异性碱基设计的位置。 2.多位点复合扩增的PCR反应条件。,四、随机引物PCR random primer PCR 特点：1.PCR反应仅1条引物。 2.引物碱基序列随机。 3.引物长度10bp左右。 4.复性温度低。 5. 扩增片段多,但符合孟德尔遗 传规律。 6.可多引物复合扩增,增加信息含 量。 7.重复性欠佳。,五、PCR单链构型多态性分析PCR-s

24、ingle strand conformation polymorphism,PCR-SSCP 1、基本原理：PCR产物热变性后形成单链 DNA，在非变性凝胶中，因DNA 片段碱基排列顺序的不同，单链 DNA形成不同的（空间构型，导 致电泳迁移率的差别而呈现多态 性，根据谱带的位置判定型别。,2、特点： A：样品需要充分变性（加样品缓冲液，沸水浴 10min），并保持至电泳前。 B：电泳凝胶为非变性凝胶。 C：泳动过程中温度保持恒定。 D：分辨率高，可检测出单一碱基变异，检出率90% 以上。 E：重复性稍差，多用于筛选实验。 F：不能确定突变碱基的种类与位置。 G：样品片段应短于500bp。

25、H：电泳谱型可能出现四条片段（1处变异）：同源双 链；异源双链；两种碱基排列顺序不同的单链DNA。,六、扩增片段长度多态性检测法 amplified fragment length polymorphism,AMP-PCR 1、基本原理：应用一对特异性引物，选择VNTR或STR基因座进行PCR扩增，由于基因座不同等位基因串联重复次数的差异，导致PCR产物DNA片段数目与长度不同，经电泳后，依据谱带的数目和位置判定型别。,2、特点： A：操作简单，重复性好。 B：泳动中根据等位基因标准品认定型别。 C：可检测的基因座数量多。 D：可将多基因座复合扩增。 复合扩增要求： A：引物间无互补序列。 B

26、：基因座不在同一染色体上，或距离足够远。 C：不同基因座PCR产物片段长度分布不交叉。 D：不同基因座PCR扩增条件相近。 E：片段长度差异不宜过大。（优势扩增） F：变性胶检测效果好。,3、用于检测的STR基因座选择条件： A：重复序列碱基数目3-5之间，易于分辨。 B：等位基因数目适中，10个左右。 C：各等位基因频率分布均匀。 D：杂合度高。 E：扩增片段长度小于300 bp。 F：突变率低。 G：避免检测连锁的基因座.（影响计算结果）,七、小卫星重复单位变异分型 ministatellite variant repeat mapping,MVR-PCR 1、基本原理：部分VNTR基因座

27、的重复序列存在碱基变异，据此设计相应的序列特异性引物，与共通引物分别进行PCR扩增，分泳道对比电泳检测PCR产物，根据谱带的有无与位置编码后判定型别。 2、特点：A：DNA片段数目多，类似DNA指纹图。 B：分辨率高，个人识别能力高。 C：编码分型，不需标准对照。 D：普通检测手段不能够反映全基因状况。 E：反映了基因座长度多态性与已知序列多态性的性 质。,八、DNA序列分析（双脱氧核苷酸末端终止法） 1、基本原理：在常规PCR反应体系中加入四种2，3-双脱氧 单核苷酸，由1条引物进行PCR反应，在正常的模DNA 复制同时，当有2，3-双脱氧单核苷酸结合到产物3端 后，下一个单核苷酸不能够与之

28、形成磷酸二酯键，使 DNA 片段延伸终止于该2，3-双脱氧单核苷酸处，根据 不同长度含有2，3-双脱氧单核苷酸片段的检测结果判 定PCR产物的单核苷酸序列。 2、特点： A：完全忠实地反映靶片段核苷酸排列顺序。 B：测序反应为1条引物（浓度低于常规PCR反应）。 C：根据方法学，一次反应可测200-500 bp。 D：产物分析分别有手工与机器自动化方法。,第五部分 DNA遗传标记的特殊意义,一、线粒体DNA遗传标记的法医学意义 1. 线粒体DNA（mitochondrial DNA,mtDNA）基本结构特点 环形双链；无组蛋白而裸露；全长16 569bp；除基因区域外有5%-7% 的D-环区（

29、displacement loop），多态性高；单倍体无重组。 2. 线粒体DNA的特征与法医学意义 A：稳定的母系遗传：母系血缘亲属具有完全相同的mtDNA。适合特殊 类型的亲权鉴定（母-子；同胞兄妹；母系血缘）。 B：拷贝数多：有利于微量检材；检测敏感度高。 C：片段短：抗降解，有利于降解检材，如角化组织（毛发等）。 D：突变率高：多态性高，个人识别能力强。 E：属于序列多态性，检测方法RFLP；ASPCR；PCR-ASO；测序等。 F：单倍体型具有民族特征。 G：单倍体型具有种属特征。 3. 线粒体DNA法医学应用的问题点 A：遗传的特殊性带来的个人识别局限性。 B：异质性；同一个体不同

30、器官或同一器官出现序列不同的mtDNA。,二、Y染色体DNA遗传标记的法医学意义 1.Y染色体DNA特征与法医学意义 A：父系伴性遗传：父系血缘男性具有完全相同的Y染色 体DNA遗传标记。适合特殊类型的亲权鉴定（父- 子；同胞兄弟；父系血缘）。 B：男性仅有：适合于含有男性成分的混合斑检验。 C：单倍体型具有民族特征。 D：同时进行性别鉴定。 E：多态性种类以STR为主，并 2. 线粒体DNA法医学应用的问题点 A：遗传的特殊性带来的个人识别局限性。 B：其他男性成分地污染。 C：约5%的X染色体重组区的STR基因座的X染色体共有。,三、DNA分子水平的性别与种属鉴定 1. DNA分子水平的性

31、别鉴定 DNA分子水平的性别鉴定的基本原理是X与Y染色体的特异基 因的检测。 A：牙釉基因（amelogenin,AMG）-X染色体的特异编码牙釉蛋白基因；类牙釉基因（amelogenin-like,AMGL）-Y染色体的特异编码牙釉蛋白基因，与AMG基因有90%同源性，AMG基因有一段插入序列，导致基因片段长度长。由1对引物可同时扩增出X与Y染色体的相应基因片段。X染色体-977bp产物；Y染色体-977bp与788bp两个产物。 B：Y染色体的性别决定区（sex detemination region Y,SRY）,位于Y染色体的着丝点近拟常染区，一个外显子，约1kb，表达蛋白诱导睾丸发育

32、。根据该基因的一段保守序列设计引物，可以扩增出254bp的片段。 分析要点：避免扩增失败假阴性，应加Alu序列作对照；不等交换所至性别异常；基因突变所至性别异常。 C：Y染色体的特异STR基因座的检出。,2. DNA分子水平的种属鉴定 DNA分子水平的种属鉴定的基本原理是染色体上人类特异基因(片段)的检测。包括人与动物的鉴别和动物间的鉴别。 A：Alu序列；属于散在重复序列短片段间隔型（short interspersed segment,SINEs），具有人及灵长类动物特征的SINEs片段长约300bp，300-900万个，内部存在限制性内切酶Alu识别部位，称之Alu序列。 检测法（1）A

33、lu探针杂交斑点法，基因组DNA直接点膜。 （2）PCR法：Alu片段特异性引物，130bp的产物。 B：28s rRNA、SON基因3非编码区等，依据不同种属动物相应片段内部的碱基插入与缺失，PCR片段长度差异鉴别动物。 C： mtDNA细胞色素b基因：人与其他哺乳动物细胞色素b基因内部有Alu识别部位；鸟类有Nco识别部位，依据不同种属动物细胞色素b基因碱基序列不同，其PCR产物酶切片段长度与数目产生差别而鉴定种属。 D：STR基因座的种属差异。,斑迹检查,一、血痕检测 顺序：肉眼观察-预备试验-确证试验-种属鉴别-遗传标记检测-其他检测。 1、肉眼观察：数量、形态、位置、色泽、大小等，案

34、件发生过程。 2、预备实验preliminary test 目的：是否为血液。 检测指标：血红蛋白或正铁血红素-血液的主要成分。 基本原理：血红蛋白或正铁血红素具有过氧化物酶活性，使过氧化氢分解产生新生态氧，0可以氧化某种化学物质形成有颜色的新化学物质，以证明可能是血液。 特点：敏感性高，特异性差。阴性可否定血痕，阳性疑为血痕。 方法：联苯胺试验-联苯胺蓝 酚酞试验-在碱性环境中还原酚酞-酚酞（红色）,2、确证试验conclusive test 目的：是否为血液。 检测指标：血红蛋白或其衍生物-血液的主要成分。 基本原理：血红蛋白在酸（碱）性条件下可分解成血红素，血红素与某些化学物质反应可生成

35、血红素结晶。以证明是血液。 特点：敏感性较高，特异性好。阴性可否定血痕，阳性为血痕。 方法：血色原结晶试验-含氮化合物（吡啶）血色原结晶桃红色。 氯化血红素结晶试验-氯化血红素结晶。 血红蛋白吸收光谱检测，血细胞涂片检测。,3、种属鉴别species identification 目的：是否为人血或何种动物血液。 检测指标：人及动物血红蛋白或血清蛋白。 基本原理：应用血红蛋白或血清蛋白特异性抗体，根据血清学抗 原抗体反应原理，出现免疫复合物为阳性，判定种属。 常用抗体：抗人血红蛋白抗体种属、器官双特异性。 抗人血清蛋白抗体种属特异性。 方法：沉淀反应precipitation； 环状沉淀反应；

36、琼脂扩散实 验（单向与双向）；对流免疫电泳；酶联免疫试验。 注意：交叉反应；种属特异性。 生物化学方法：血红蛋白等电聚焦。 4、遗传标记检测 A：ABO型检测：吸收实验absorption-标准化抗体1：32 解离试验elution-高效价抗体 混合凝集试验mixed agglutination-高亲合力抗体。 B：其他遗传标记检测,二、精斑检验 1、定性试验 1）.预备试验：酸性磷酸酶检出法 法医学意义：酸性磷酸酶在前列腺分泌物中含量最高。 酸性磷酸酶化学性质稳定。 检测方法简单敏感，万余倍。 2）.确证试验： A:精子检出：最可靠，注意无精子症患者。 B:乳酸脱氢酶-X(lactate d

37、ehydrogenase,LDH)检出： 源于精子，活性最高。意义同精子检出。3-4之间。 C: -精浆蛋白(-seminoprotein, -sm检出： 源于前列腺，为糖蛋白，也称作P30（分子量3 万），化学性质稳定，无精子症患者无影响。 D：-微精浆蛋白(-microseminoprotein, -MSP 检出： 源于前列腺的蛋白，无精子症患者无影响。 E：精子黄递酶（diaphorase,DIA）3多态性检出： 源于精子，意义同精子检出。,3）遗传标记检测： A：二步消化法，检测常染色体遗传标记。 B：Y染色体遗传标记检测。 C：常规血型检测（ABO吸收、解离； PGM1、DIA3、G

38、LO等酶型；GC、 ORM1、GM、KM等血清蛋白型。） D：DIA3型检测（无精子症，精子对照）。,三、精液与阴道液混合斑的检验 1、定性试验 A：阴道脱落上皮的检出。 B：阴道肽酶（vaginal peptidase,Vp）的检出。 2、混合斑的男性遗传标记检测。 A：常规血型检测结果对比推断法： B：二步消化法，检测常染色体遗传标记。 C：Y染色体遗传标记检测。 D：男性成分分离检测法； 1） DIA3型检测。 2） 2-精浆糖蛋白（2-seminoglycoprotein, 2-SGP）检测。 源于精囊腺，为精液ABH物质，应用其抗体分离混合斑的男性 ABH物质，检测ABO血型。 3） 抗人精浆抗体分离男性成分ABO血型检测。,一、基因型频率计算 基因型频率（genotype frequency）：在一个群体中，某基因座上不同基因型在全部个体中所占的百分比。根据等位基因频率计算。